Dieser Artikel stellt eine Methode zur Erzeugung von Proteinkristallen dar, die mit I3C (5-Amino-2,4,6-Triiodoisophthalsäure) mit Mikrosaatierung zur Erzeugung neuer Kristallisationsbedingungen in spärlichen Matrix-Bildschirmen deaktiviert werden. Die Schalen können mit Flüssigkeitsdosierrobotern oder von Hand aufgestellt werden.
Die Proteinstrukturaufklärung mittels Röntgenkristallographie erfordert sowohl hochwertige diffrierende Kristalle als auch eine rechnerische Lösung des Beugungsphasenproblems. Neuartige Strukturen, denen ein geeignetes Homologiemodell fehlt, werden oft mit schweren Atomen ableitungsiert, um experimentelle Phaseninformationen zu liefern. Das vorgestellte Protokoll erzeugt effizient derivatisierte Proteinkristalle, indem zufälliges Mikrosaating-Matrix-Screening mit Derivatisierung mit einem schweren Atommolekül I3C (5-Amino-2,4,6-Triiodoisophthalsäure) kombiniert wird. Durch die Einbindung von I3C in das Kristallgitter kann das Problem der Beugungsphase effizient mit einer einzigen Wellenlängen-Anomaldispersion (SAD) gelöst werden. Die gleichseitige Dreiecksanordnung von Jodatomen in I3C ermöglicht eine schnelle Validierung einer korrekten anomalen Unterkonstruktion. Dieses Protokoll wird für Strukturbiologen nützlich sein, die makromolekulare Strukturen mit kristallographischen Techniken lösen, die an experimentellem Phasing interessiert sind.
Im Bereich der Strukturbiologie gilt die Röntgenkristallographie als die Goldstandardtechnik zur Bestimmung der atomaren Auflösungsstrukturen von Makromolekülen. Es wurde ausgiebig genutzt, um die molekulare Basis von Krankheiten zu verstehen, rationale Arzneimitteldesign-Projekte zu leiten und den katalytischen Mechanismus der Enzyme1,2aufzuklären. Obwohl Strukturelle Daten eine Fülle von Wissen liefern, kann der Prozess der Proteinexpression und -reinigung, Kristallisation und Strukturbestimmung äußerst mühsam sein. Häufig treten mehrere Engpässe auf, die den Fortschritt dieser Projekte behindern, und dies muss angegangen werden, um die Pipeline zur Bestimmung der Kristallstruktur effizient zu rationalisieren.
Nach rekombinanter Expression und Reinigung müssen vorgegebene Bedingungen identifiziert werden, die der Kristallisation förderlich sind, was oft ein mühsamer und zeitaufwändiger Aspekt der Röntgenkristallographie ist. Kommerzielle spärliche Matrix-Bildschirme, die bekannte und veröffentlichte Bedingungen konsolidieren, wurden entwickelt, um diesen Engpass zu lindern3,4. Es ist jedoch üblich, trotz der Verwendung von hochreinen und konzentrierten Proteinproben nur wenige Treffer aus diesen Anfangsbildschirmen zu generieren. Die Beobachtung klarer Tropfen deutet darauf hin, dass das Protein möglicherweise nicht die Übersättigungswerte erreicht, die erforderlich sind, um einen Kristall zu nukleieren. Um die Kristallkernbildung und das Wachstum zu fördern, können Samen aus bereits vorhandenen Kristallen zu den Bedingungen hinzugefügt werden, was eine erhöhte Probenahme des Kristallisationsraums ermöglicht. Ireton und Stoddard führten erstmals das Mikrosaat-Matrix-Screening-Verfahren5ein. Minderwertige Kristalle wurden zerkleinert, um einen Samenbestand herzustellen, und dann systematisch zu Kristallisationsbedingungen hinzugefügt, die verschiedene Salze enthalten, um neue Kristalle in Beugungsqualität zu erzeugen, die sich sonst nicht gebildet hätten. Diese Technik wurde weiter verbessert durch D’Arcy et al., die zufälliges Mikrosaatmatrix-Screening (rMMS) entwickelten, bei dem Samen in einen Ersatzmatrixkristallisationssieb 6,7eingeführt wurden. Dies verbesserte die Qualität der Kristalle und erhöhte die Anzahl der Kristallisationstreffer im Durchschnitt um den Faktor 7.
Nachdem Kristalle erfolgreich hergestellt und ein Röntgenbeugungsmuster erhalten ist, tritt ein weiterer Engpass in Form der Lösung des “Phasenproblems” auf. Während des Datenerfassungsprozesses wird die Intensität der Beugung (proportional zum Quadrat der Amplitude) aufgezeichnet, aber die Phaseninformationen gehen verloren, was zu dem Phasenproblem führt, das die sofortige Strukturbestimmungstoppt 8. Wenn das Zielprotein eine hohe Sequenzidentität zu einem Protein mit einer zuvor festgelegten Struktur teilt, kann der molekulare Ersatz verwendet werden, um die Phaseninformationen9,10,11,12zu schätzen. Obwohl diese Methode schnell und kostengünstig ist, sind Modellstrukturen möglicherweise nicht verfügbar oder ungeeignet. Der Erfolg der homologischen modellbasierten molekularen Ersatzmethode sinkt deutlich, da die Sequenzidentität unter 35%13fällt. In Ermangelung eines geeigneten Homologiemodells können ab initio Methoden wie ARCIMBOLDO14,15 und AMPLE16getestet werden. Diese Methoden verwenden rechnerisch vorhergesagte Modelle oder Fragmente als Ausgangspunktfürbeinen für den molekularen Ersatz. AMPLE, das vorhergesagte Ködermodelle als Ausgangspunkte verwendet, kämpft darum, Strukturen großer (>100 Rückstände) Proteine und Proteine zu lösen, die überwiegend β-Blätter enthalten. ARCIMBOLDO, das versucht, kleine Fragmente in eine größere Struktur zu passen, ist auf hochauflösende Daten (≤2) und durch die Fähigkeit von Algorithmen beschränkt, die Fragmente zu einer vollständigen Struktur zu erweitern.
Wenn molekulare Ersatzmethoden fehlschlägt, müssen direkte Methoden wie isomorpher Ersatz17,18 und anomale Streuung bei einer einzigen Wellenlänge (SAD19) oder mehreren Wellenlängen (MAD20) verwendet werden. Dies ist oft der Fall bei wirklich neuartigen Strukturen, bei denen der Kristall mit einem schweren Atom gebildet oder ableitungen muss. Dies kann durch Einweichen oder Kokristallisieren mit einer schweren Atomverbindung, chemische Modifikation (wie 5-Bromouracil-Inkorporation in RNA) oder markierte Proteinexpression (wie die Einbeziehung von Selenomethionin oder Selenocystein-Aminosäuren in die primäre Struktur) erreicht werden21,22. Dies erschwert den Kristallisationsprozess zusätzlich und erfordert zusätzliches Screening und Optimierung.
Eine neue Klasse von Phasing-Verbindungen, einschließlich I3C (5-Amino-2,4,6-Triiodoisophthalsäure) und B3C (5-Amino-2,4,6-Tribromoisophthalsäure), bieten spannende Vorteile gegenüber bereits bestehenden Phasing-Verbindungen23,24,25. Sowohl I3C als auch B3C verfügen über ein aromatisches Ringgerüst mit einer abwechselnden Anordnung von anomalen Streuungen, die für direkte Phasing-Methoden und Amino- oder Carboxylat-Funktionsgruppen erforderlich sind, die speziell mit dem Protein interagieren und eine Bindungs-Standortspezifität bieten. Die anschließende gleichseitige dreieckige Anordnung von Schwermetallgruppen ermöglicht eine vereinfachte Validierung des phasing-Unterbaus. Zum Zeitpunkt des Schreibens gibt es 26 I3C-gebundene Strukturen in der Protein Data Bank (PDB), von denen 20 mit SAD phasing26gelöst wurden.
Dieses Protokoll verbessert die Wirksamkeit der Strukturbestimmungspipeline, indem die Methoden der Schwermetall-Derivatisierung und des rMMS-Screenings kombiniert werden, um gleichzeitig die Anzahl der Kristallisationstreffer zu erhöhen und den Kristallderivatisierungsprozess zu vereinfachen. Wir haben gezeigt, dass diese Methode extrem effektiv mit Hühnerei-Weiß-Lysozym und einer Domäne eines neuartigen Lysinproteins aus Bakteriophagen P6827ist. Die Strukturlösung mit der hochautomatisierten Auto-Rickshaw-Strukturbestimmungspipeline wird speziell auf die Phasing-Verbindung I3C zugeschnitten beschrieben. Es gibt andere automatisierte Pipelines, die verwendet werden können, wie AutoSol28, ELVES29 und CRANK230. Nicht vollautomatisierte Pakete wie SHELXC/D/E können auch31,32,33verwendet werden. Diese Methode ist besonders vorteilhaft für Forscher, die Proteine ohne homologe Modelle im PDB untersuchen, indem sie die Anzahl der Screening- und Optimierungsschritte signifikant reduziert. Voraussetzung für diese Methode sind Proteinkristalle oder ein kristalliner Niederschlag des Zielproteins, das aus früheren Kristallisationsversuchen gewonnen wurde.
Die Strukturbestimmung eines neuartigen Proteins in Ermangelung eines geeigneten Homologiemodells für den molekularen Ersatz erfordert eine experimentelle Phasing. Diese Methoden erfordern die Einbindung schwerer Atome in den Proteinkristall, was der Strukturbestimmungspipeline eine zusätzliche Komplexität verleiht und zahlreiche Hindernisse mit sich bringen kann, die angegangen werden müssen. Schwere Atome können durch etikettierte Expression mit Selenomethionin und Selenocystein direkt in das Protein eingearbeitet werden. Da diese Methode kostspielig, mühsam ist und zu niedrigeren Proteinerträgen führen kann, wird markiertes Protein oft ausgedrückt, nachdem Kristallisationsbedingungen gefunden und mit nicht gekennzeichnetem Protein optimiert wurden. Alternativ können Kristalle durch Einweichen in eine Lösung mit schweren Atomen22,63,64absaugt werden. Diese Methode verwendet häufig hochwertige Kristalle und wird daher durchgeführt, nachdem bereits eine robuste Kristallisationsmethode entwickelt wurde. Die erfolgreiche Beschaffung eines derivatisierten Kristalls mit dieser Methode erfordert eine weitere Optimierung der Einweichverfahren und das Screening verschiedener Phasing-Verbindungen, wodurch einem bereits mühsamen Prozess mehr Zeit eingezäutt wird.
Die Kokristallisation des Proteins mit dem schweren Atom kann im Screening-Stadium durchgeführt werden, wodurch der Prozess effizient gestrafft und Kristallmanipulationsschritte reduziert werden, die Schäden verursachen können. Es gibt jedoch immer noch das mögliche Szenario, nur wenige anfängliche Kristallisationstreffer zu erhalten, und das Problem der Wahl einer kompatiblen schweren Atomverbindung. Viele derzeit verfügbare Phasing-Compounds sind inkompatibel mit Niederschlagsmitteln, Puffern und Additiven, die häufig unter Kristallisationsbedingungen zu finden sind. Sie können in Sulfat- und Phosphatpuffern unlöslich sein, zu Citrat und Acetat chelaten, ungünstig mit HEPES- und Tris-Puffern reagieren oder sich durch DTT und β-Mercaptoethanol21sequestrieren lassen. Da die Phasing-Verbindung I3C nicht unter diesen Inkompatibilitäten leidet, ist es eine robuste Phasing-Verbindung, die für viele verschiedene Bedingungen zugänglich sein könnte.
In dieser Studie wird eine schlanke Methode zur Herstellung von derivatisierten Kristallen vorgestellt, die für die SAD-Phasing durch gleichzeitige Kokristallisation der I3C-Phasing-Verbindung und rMMS bereit sind. Die Kombination beider Techniken erhöht die Anzahl der Kristallisationstreffer, wobei viele der Bedingungen eine verbesserte Morphologie und Beugungseigenschaften aufweisen. In orf11 NTD- und HEWL-Testfällen wurden neue Bedingungen im I3C-rMMS-Bildschirm identifiziert, die fehlten, als I3C nicht vorhanden war. Potenziell kann I3C günstig an das Protein binden, was die Bildung und Stabilisierung von Kristallkontakten erleichtert27. Dies wiederum kann Kristallisation induzieren und möglicherweise die Beugungseigenschaften verbessern. I3C ist nicht nur eine Verbindung, die mit spärlichen Matrix-Bildschirmen kompatibel ist, sondern ist aufgrund seiner intrinsischen Eigenschaften auch eine attraktive Phasing-Verbindung. Die funktionellen Gruppen, die sich mit Jod auf dem aromatischen Ringgerüst abwechseln, ermöglichen eine spezifische Bindung an Proteine. Dies führt zu einer höheren Belegung und reduziert möglicherweise das Hintergrundsignal23. Darüber hinaus ist die Anordnung anomaler Streuer in einem gleichseitigen Dreieck im Unterbau offensichtlich und kann verwendet werden, um die Bindung von I3C schnell zu validieren (Abbildung 4B und 4C). Schließlich kann es ein anomales Signal mit abstimmbarer Synchrotronstrahlung sowie Chrom- und Kupfer-rotierenden Anoden-Röntgenquellen erzeugen. Somit kann es auf viele verschiedene Workflows angewendet werden. Da I3C weit verbreitet und kostengünstig zu erwerben ist, ist dieser Ansatz für die meisten laboratorien für Strukturbiologie in Reichweite.
Es gibt mehrere experimentelle Überlegungen, die bei der Verwendung der I3C-rMMS-Methode berücksichtigt werden müssen. Diese Methode kann nicht angewendet werden, wenn das ursprüngliche kristalline Material des Proteins nicht gewonnen werden kann. In schwierigen Fällen kann kristallines Material aus einem homologen Protein auch zur Erzeugung von Saatgutverwendet werden. Dieser Cross-Seeding-Ansatz für rMMS hat einige vielversprechende Ergebnisse gezeigt7. Die Optimierung der Kristallzahl durch Verdünnung des Saatgutbestands ist ein entscheidender Schritt, der nicht übersehen werden sollte, um die Chance zu maximieren, hochwertige große Kristalle zu produzieren und geeignete Beugungsdaten zu erhalten. Wenn in der asymmetrischen Einheit nur wenige I3C-Standorte identifiziert werden, sollten die für die Kristallisation förderlichen Bedingungen mit einer erhöhten Konzentration von I3C weiter optimiert werden. Dies kann die Belegung von I3C erhöhen, um das anomale Signal zu maximieren und die Kristallableitung zu unterstützen.
Es kann Fälle geben, in denen diese Technik möglicherweise nicht die optimale Methode zur Ableitung von Proteinkristallen ist. Da die Größe eines Protein- oder Proteinkomplexes zunimmt, bietet die begrenzte Anzahl von I3C-Standorten auf der Proteinoberfläche möglicherweise nicht genügend Phasing Power, um die Struktur zu lösen. In diesen Szenarien, in denen die Proteingröße im Verdacht steht, die Phasing-Zeit zu behindern, kann die Selenomethionin-Kennzeichnung des Proteins ein praktikablerer Ansatz für die Phasing des Proteins sein. Wenn das Protein eine ausreichende Anzahl von Methioninrückständen im Protein aufweist (empfohlen mit mindestens einem Methionin pro 100 Rückstände65) und eine hocheffiziente Selenomethionin-Inkorporation in ein Protein erreicht werden kann (z. B. in bakteriellen Expressionssystemen66), werden mehrere Selenatome mit hoher Belegung in den Kristallen vorhanden sein, um die Struktur zu phasen.
Darüber hinaus können einige Proteine von Natur aus ungeeignet für die Ableitung mit I3C sein. I3C-Bindungsstellen an Proteinen sind von der Proteinstruktur abhängig. Es kann Proteine geben, die natürlich nur wenige exponierte Pflaster haben, die mit der I3C-Bindung kompatibel sind. Daher ist es nicht unvorhersehbar, dass es Schwierigkeiten bei der Kokristallisation einiger Zielproteine mit I3C geben kann.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde an der MX1-Beamline am Australian Synchrotron, einem Teil von ANSTO, durchgeführt. Die Autoren möchten die Mitglieder der Laboratorien Shearwin und Bruning für die Diskussionen über diese Arbeit würdigen. Die Autoren möchten auch Dr. Santosh Panjikar und Dr. Linda Whyatt-Shearwin würdigen, die zu der ursprünglichen Arbeit beigetragen haben, die dieses Protokoll als Pioniere war.
Folgende Finanzierung wird anerkannt: Australian Research Council (Grant No. DP150103009 und DP160101450 an Keith E. Shearwin); University of Adelaide (Australian Government Research Training Program Stipendium an Jia Quyen Truong und Stephanie Nguyen).
10 mL disposable luer lock syringes | Adelab Scientific | T3SS10LAT | Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells |
24 well tissue culture plate | Sigma Aldrich | CLS3527 | Used for hanging drop crystal tray |
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid | Alfa Aesar | B22178 | Commonly referred to as I3C in the article |
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original | Hampton Research | HR3-297 | For 96 well crystallization screens set up by robot |
Coverslips | Thermo Fisher Scientific | 18X18-2 | Coverslips for hanging drop crystal tray wells |
Dow Corning vacuum grease | Hampton Research | HR3-510 | Used for sealing hanging drop crystal tray wells |
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL | Eppendorf | 3120000011 | |
Gilson Pipette 2 μL-20 μL | John Morris Group | 1153247 | |
Gilson Pipette 20 μL-200 μL | John Morris Group | 1152006 | |
Glass pasteur pipettes | Adelab Scientific | HIR92601.01 | |
Hen Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Approximately 95% pure |
IndexHT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
Microscope illuminator | Meiji Techno | FT192/230 | Light source to illuminate crystallography experiments |
PEG/ION HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
Phoenix Liquid Dispenser | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
Scalpel with scalpel blade no. 15 | Adelab Scientific | LV-SMSCPO15 | |
Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol. |
Stereo microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | Microscope for visualising crystallography experiments |
Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415 | |
Vortex mixer | Adelab Scientific | RAVM1 |