Визуализация кальцитонина Гена связанных пептид иммунореактивной иннервации Крыса Краниал Дура Матер с иммунофторесценции и нейронной трассировки
Özet
Здесь мы представляем протокол для визуализации пространственной корреляции кальцитонина гена связанных пептид (CGRP)-иммунореактивных нервных волокон и кровеносных сосудов в черепно-мозговой матер с использованием иммунофторесценции и флуоресцентной гистохимии с CGRP и фаллоидин, соответственно. Кроме того, происхождение этих нервных волокон было ретроградным, прослеживаемым с помощью флуоресцентного нервного трассировщика.
Abstract
Целью данного исследования было изучение распределения и происхождения пептида, связанного с геном кальцитонина (CGRP)-иммунореактивных сенсорных нервных волокон черепной мозговой оболочки с использованием иммунофторесценции, трехмерной (3D) реконструкции и ретроградной техники отслеживания. Здесь нервные волокна и кровеносные сосуды были окрашены с помощью иммунофлуоресценции и гистохимии методы с CGRP и флуоресцентный фаллоидин, соответственно. Пространственная корреляция дюральных CGRP-иммуореактивных нервных волокон и кровеносных сосудов была продемонстрирована 3D-реконструкцией. Между тем, происхождение CGRP-иммунореактивных нервных волокон были обнаружены нервной техники отслеживания с фторгольдом (FG) из области вокруг средней менингеальной артерии (MMA) в черепной dura mater к тригеминальной ганглиона (TG) и шейки матки (C) спинного корня ганглиев (DRGs). Кроме того, были также изучены химические характеристики нейронов, помеченных FG в TG и DRG, а также CGRP с использованием двойных иммунофлюоресценций. Воспользовавшись прозрачным образцом цельного монтажа и 3D-реконструкцией, было показано, что CGRP-иммунореактивные нервные волокна и артериолы с маркировкой фаллоидин работают вместе или отдельно образуют дурную нейрососудикулярную сеть в 3D-виде, в то время как FG-помеченные нейроны были найдены в офтальмологических, челюстно-челюстных и мандибулярной ветвях TG, а также C2-3 DRGs ipsilateral в сторону применения трассировщика, в котором некоторые из FG-помеченных нейронов, представленных с CGRP-иммунореактивным выражением. С помощью этих подходов мы продемонстрировали распределительные характеристики CGRP-иммунореактивных нервных волокон вокруг кровеносных сосудов в черепной матер-дуре, а также происхождение этих нервных волокон из ТГ и ДРГ. С точки зрения методологии, это может стать ценным справочником для понимания сложной нервно-мышечной структуры мозговой мозговой оболочки при физиологическом или патологическом состоянии.
Introduction
Черепная dura mater является внешним слоем опоясывания для защиты мозга и содержит обильные кровеносные сосуды и различные видынервных волокон 1,2. Многие исследования показали, что сенсибилизированные черепные dura mater может быть ключевым фактором, ведущим к возникновению головных болей, с участием ненормальной вазодилатации и иннервации3,4,5. Таким образом, знание нервно-мышечной структуры в черепной dura mater имеет важное значение для понимания патогенеза головных болей, особенно при мигрени.
Хотя иннервация дуры ранее изучалась с помощью обычной иммуногистохимии, пространственная корреляция нервных волокон и кровеносных сосудов в черепной мозговой оболочкебыла менее изучена 6,7,8,9. Для того, чтобы выявить dural нервно-сосудистой структуры более подробно, кальцитонин гена связанных пептид (CGRP) и фаллоидин были выбраны в качестве маркеров для соответственно окрашивания дюрал нервных волокон и кровеносных сосудов в цельно-монтажной черепной dura матер с иммунофлуоресценции и флуоресцентнойгистохимии 10. Это может быть оптимальным выбором для получения трехмерного (3D) взгляда на нервно-мышечную структуру. Кроме того, флюорогольд (FG) был применен на области вокруг средней менингеальной артерии (MMA) в черепной dura mater, чтобы определить происхождение CGRP-иммунореактивных нервных волокон, и прослеживается в тригеминальный ганглий (TG) и шейки матки (C) спинной корневой ганглии (DRG), в то время как FG-помечены нейроны были дополнительно изучены вместе с CGRP.
Целью данного исследования было обеспечить эффективный инструмент для исследования нервно-мышечной структуры в черепной dura mater для CGRP-иммунореактивной иннервации и ее происхождения. Воспользовавшись прозрачной цельно-монтировкой dura mater и сочетая иммунофлуоресценцию, ретроградное отслеживание, конфокальные методы и 3D-реконструкцию, мы ожидали представить новый 3D-вид нервно-мышечной структуры в черепной мозговой матер. Эти методологические подходы могут быть дополнительно служил для изучения патогенеза различных головных болей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы успешно продемонстрировали распределение и происхождение CGRP-иммунореактивных нервных волокон в черепной дюра-матер с использованием иммунофторесценции, 3D реконструкции и нейронных подходов к отслеживанию с антителами CGRP и FG нейронным трассировщиком, обеспечи…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано проектом Национальной ключевой программы НИОКР Китая (Проектный кодекс No 2019YFC1709103; No 2018YFC1707804) и Национального фонда естественных наук Китая (Проектный кодекс No 81774211; No 81774432; No 81801561).
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
Referanslar
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Nörobilim. 338, 130-144 (2016).
- Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
- Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint “Taichong” (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
- Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
- Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
- Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
- Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
- Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
- Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Nörobilim. 129, 431-437 (2004).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
