تصور الكالسيتونين الجينات ذات الصلة الببتيد المناعي الداخلي من الجرذ الجمجمة دورا ماتر مع Immunofluorescence والتتبع العصبي
Özet
هنا نقدم بروتوكولا لتصور الارتباط المكاني للببتيد الكالسيتونين ذات الصلة بالجينات (CGRP) – الألياف العصبية المناعية والأوعية الدموية في طرية الجمجمة باستخدام الفلورسينس المناعي والكيمياء الهستوكسية الفلورية مع CGRP و phalloidin ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، كان أصل هذه الألياف العصبية رجعيا مع تتبع عصبي فلوري.
Abstract
كان الهدف من هذه الدراسة هو دراسة توزيع وأصل الببتيد المرتبط بالكالسيتونين المرتبط بالجينات (CGRP) – الألياف العصبية الحسية المناعية من طرية الجمجمة باستخدام الفلورة المناعية وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D) وتقنية التتبع الرجعي. هنا، كانت الألياف العصبية والأوعية الدموية ملطخة باستخدام تقنيات الفلورسينس المناعي والكيمياء النسيجية مع CGRP والفلورسنت phalloidin، على التوالي. وقد تجلى الارتباط المكاني للألياف العصبية والأوعية الدموية DURAL CGRP-immuoreactive من خلال إعادة البناء ثلاثي الأبعاد. وفي الوقت نفسه، تم الكشف عن أصل الألياف العصبية النشطة المناعية CGRP عن طريق تقنية التتبع العصبي مع فلوروغولد (FG) من المنطقة المحيطة بالشريان السحائي الأوسط (MMA) في طرية الجمجمة إلى العقدة الثلاثية البروم (TG) وعنق الرحم (C) العقدة الجذرية الظهرية (DRGs). وبالإضافة إلى ذلك، تم أيضا فحص الخصائص الكيميائية للخلايا العصبية المسماة FG في TG وDRGs جنبا إلى جنب مع CGRP باستخدام الفلورفلورسينس المناعي المزدوج. الاستفادة من عينة شفافة كاملة جبل وإعادة الإعمار 3D، تبين أن الألياف العصبية CGRP-المناعية والشرايين phalloidin المسمى تشغيل معا أو تشكيل شبكة الأوعية الدموية العصبية دورال بشكل منفصل في عرض 3D، في حين تم العثور على الخلايا العصبية FG المسمى في فروع العيون، الفك العلوي، والمانديبولار من TG، فضلا عن C2-3 DRGs ipsilateral إلى جانب تطبيق التتبع الذي بعض الخلايا العصبية FG المسمى قدم مع التعبير CGRP-المناعي. مع هذه النهج، أظهرنا الخصائص التوزيعية للألياف العصبية النشطة المناعية CGRP حول الأوعية الدموية في طرية الجمجمة، فضلا عن أصل هذه الألياف العصبية من TG وDRGs. من منظور المنهجية ، قد يوفر مرجعا قيما لفهم البنية العصبية الوعائية المعقدة لمدرس الغور القحفي تحت الحالة الفسيولوجية أو المرضية.
Introduction
إن الطرية القحفية هي الطبقة الخارجية من السحايا لحماية الدماغ وتحتوي على أوعية دموية وفيرة وأنواع مختلفة من الألياف العصبية1،2. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن حساسة دورا القحفية ماتر قد يكون العامل الرئيسي الذي يؤدي إلى حدوث الصداع, تنطوي على توسع الأوعية غير طبيعية و الداخلي3,4,5. وهكذا، فإن معرفة بنية الأوعية الدموية العصبية في الطرية القحفية أمر مهم لفهم مسببات الأمراض من الصداع، وخاصة بالنسبة للصداع النصفي.
على الرغم من أن ال الداخلي دورا قد درس سابقا مع الكيمياء المناعية التقليدية، والارتباط المكاني للألياف العصبية والأوعية الدموية في الطرية القحفية كانت أقل درس6،7،8،9. من أجل الكشف عن بنية الأوعية الدموية العصبية دورال بمزيد من التفصيل، تم اختيار الببتيد الكالسيتونين الجينات ذات الصلة (CGRP) وphalloidin كعلامات لتلطيخ على التوالي الألياف العصبية الجافية والأوعية الدموية في كامل جبل دورا القحفية ماتر مع immunofluorescence والكيمياء النسيجية الفلورية10. قد يكون الخيار الأمثل للحصول على عرض ثلاثي الأبعاد (3D) للبنية العصبية الوعائية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق الفلوروغولد (FG) على المنطقة المحيطة بالشريان السحائي الأوسط (MMA) في طرية الجمجمة لتحديد أصل الألياف العصبية المناعية CGRP ، وتتبعت إلى العقدة الثلاثية البروم (TG) وعنق الرحم (C) العقدة الجذرية الظهرية (DRGs) ، في حين تم فحص الخلايا العصبية المسماة FG مع CGRP باستخدام immunofluorescence.
كان الهدف من هذه الدراسة هو توفير أداة فعالة للتحقيق في بنية الأوعية الدموية العصبية في طرية الجمجمة ل الداخلي CGRP-المناعي ومصدره. من خلال الاستفادة من شفافة كاملة جبل دورا ماتر والجمع بين immunofluorescence، تتبع الرجعية، وتقنيات confocal، وإعادة الإعمار 3D، كنا نتوقع لتقديم وجهة نظر 3D رواية من بنية الأوعية الدموية العصبية في ماتر دورا الجمجمة. ويمكن مواصلة تقديم هذه النهج المنهجية لاستكشاف مسببات الأمراض من الصداع المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، أثبتنا بنجاح توزيع وأصل الألياف العصبية النشطة المناعية CGRP في طرية الجمجمة باستخدام الفلورة المناعية، وإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد ونهج التتبع العصبي مع الأجسام المضادة CGRP والمتتبع العصبي FG، وتوفير الأدلة النسيجية والكيميائية لفهم أفضل لشبكة الأوعية الدموية العصبية ال…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذه الدراسة من خلال مشروع البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رمز المشروع رقم 2019YFC1709103؛ رقم 2018YFC1707804) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رمز المشروع رقم 81774211؛ رقم 81774432؛ رقم 81801561).
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
Referanslar
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Nörobilim. 338, 130-144 (2016).
- Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, 4-16 (2018).
- Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint “Taichong” (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
- Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
- Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
- Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
- Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
- Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
- Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Nörobilim. 129, 431-437 (2004).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
