Isolement de l’histone des tissus foliolaires de Sorgho pour le profilage de spectrométrie de masse top down des marqueurs épigénétiques potentiels

On s’attend à ce que la gravité et la fréquence croissantes de la sécheresse affectent la productivité des cultures^{céréalières 1,2}. Le sorgho est une culture céréalière d’alimentation et d’énergie connue pour sa capacité exceptionnelle à résister à des conditions limitant^{l’eau 3,4}. Nous poursuivons la compréhension mécaniste de l’interaction entre le stress dû à la sécheresse, le développement des plantes et l’épigénétique des plantes desorgho [Sorgho bicolore (L.) Moench]. Nos travaux antérieurs ont démontré de fortes connexions entre le microbiome végétaux et rhizosphère dans l’aclimation de la sécheresse et les réponses au niveau^{moléculaire 5,6,7}. Cette recherche ouvrira la voie à l’utilisation de l’ingénierie épigénétique pour adapter les cultures aux scénarios climatiques futurs. Dans le cadre des efforts de compréhension de l’épigénétique, nous visons à étudier les marqueurs protéiques qui ont un impact sur l’expression des gènes au sein de l’organisme végétal.

Les histones appartiennent à une famille de protéines très conservées dans les eucaryotes qui emballent l’ADN en nucléosomes en unités fondamentales de chromatine. Les modifications post-translationnelles (MNP) des histones sont réglées dynamiquement pour contrôler la structure de la chromatine et influencer l’expression des gènes. Comme d’autres facteurs épigénétiques, y compris la méthylation de l’ADN, les MNP histone jouent un rôle important dans^{de nombreux processus biologiques 8,9}. Des analyses à base d’anticorps comme les taches occidentales ont été largement utilisées pour identifier et quantifier les MNP histones. En outre, l’interaction des MNP histones et de l’ADN peut être efficacement sondée par immunoprécipitation de chromatine – séquençage (ChIP-seq)¹⁰. Dans ChIP-seq, la chromatine avec l’histone ciblé spécifique PTM est enrichie par des anticorps contre ce PTM spécifique. Ensuite, les fragments d’ADN peuvent être libérés de la chromatine enrichie et séquencés. Des régions de gènes qui interagissent avec l’histone ciblé PTM sont révélées. Cependant, toutes ces expériences reposent fortement sur des anticorps de haute qualité. Pour certaines variantes/homologs histones ou combinaisons de MNP, le développement d’anticorps robustes peut être extrêmement difficile (en particulier pour plusieurs MNP). En outre, les anticorps ne peuvent être développés que si l’histone PTM ciblé est connu. ¹¹ Par conséquent, des méthodes alternatives pour le profilage global non ciblé des MNP histones sont nécessaires.

La spectrométrie de masse (SP) est une méthode complémentaire pour caractériser les MNP histones, y compris les MNP inconnus pour lesquels les anticorps ne sont^{pas disponibles 11,12}. Le flux de travail bien établi de la SP « ascendante » utilise des protéases pour digérer les protéines en petits peptides avant la séparation de la chromatographie liquide (LC) et la détection de la SP. Parce que les histones ont un grand nombre de résidus de base (lysine et arginine), la digestion de la trypsine (protéase spécifique à la lysine et à l’arginine) dans le flux de travail ascendant standard coupe les protéines en peptides très courts. Les peptides courts sont techniquement difficiles à analyser par LC-MS standard, et ne préservent pas l’information sur la connectivité et la stoichiométrie de plusieurs MNP. L’utilisation d’autres enzymes ou l’étiquetage chimique pour bloquer les lysines génère des peptides plus longs qui sont plus appropriés pour la caractérisation de l’histone PTMs^13,14.

Alternativement, l’étape de digestion peut être complètement omise. Dans cette approche « descendante », des ions protéiques intacts sont introduits dans la SP par ionisation par électrospray (ESI) après la séparation en ligne du LC, ce qui donne des ions des protéoformes histones intacts. En outre, les ions (c.-à-d. protéoformes) d’intérêt peuvent être isolés et fragmentés dans le spectromètre de masse pour donner les ions de séquence pour l’identification et la localisation de PTM. Par conséquent, la SP descendante a l’avantage de préserver les informations protéoformes et de capturer la connectivité de plusieurs MNP et tronqués terminaux sur le même protéoforme^15,16. Les expériences descendantes peuvent également fournir des informations quantitatives et offrir un aperçu des biomarqueurs au niveau de protéines intactes¹⁷. Ici, nous décrivons un protocole pour extraire l’histone de la feuille de sorgho et analyser les histones intactes par LC-MS de haut en bas.

Les données d’exemple indiquées dans la figure 1 et la figure 2 proviennent de feuilles de sorgho recueillies à la semaine 2 après la plantation. Bien que l’on s’attende à une variation du rendement, ce protocole est généralement agnostique par rapport à des conditions d’échantillonnage spécifiques. Le même protocole a été utilisé avec succès pour le tissu foliaire végétaux de sorgho prélevé dans 2, 3, 5, 8, 9 et 10 semaines après la plantation.