In Situ X線回折研究のためのマイクロダイアルシスによるチップ上のタンパク質の結晶化

1. マスクデザインとマスターファブリケーション 任意のベクトル描画ソフトウェアを使用して、マイクロ流体デバイスの所望の幾何学を描きます。フォトリソグラフィの次のステップに使用されるフォトレジストの各層について、チャンネルと柱で輪郭を描いたマスクと柱のみを含むマスクを個別に用意します。 描画ソフトウェアによって生成されたCIFファイルをフィルムフォトマスクに変換します。これは、商用サービスを通じて行うことができます。フォトリソグラフィ中に使用するフォトレジストの選択に応じて、適切なフォトマスクを必要とします。メモ:SU-8フォトレジストの場合は、透明な背景に黒い特徴を持つマスクを注文します。SU-8はエポキシベースの負光抵抗であり、UV光(365nm)への曝露中にUVに曝露された部分は架橋され、残りは可溶性のままである。したがって、マスク上のすべての黒いパターンは、フォトリソグラフィ中にUV光によって架橋されません。マスターにはチャンネルと柱が刻まれています。 SU-8陰性フォトレジストを使用したフォトリソグラフィによる各チップの設計に対して、シリコンウェーハに2人のマスターを用意します。注: ステップ 1.3.1- 1.3.7 はクリーンルームで行われます。以下に説明するステップは、フォトリソグラフィの伝統的なステップとそれに続くPDMSソフトリソグラフィであり、多くの教科書に記載されている。実験パラメータ(フォトレジスト、時間の持続時間、温度など)のすべての値は、多くの微妙なパラメータに依存し、使用する異なる装置に応じて最適化する必要があります。 3インチシリコンウエハを使用し、SU-8フォトレジストの堆積と取り付けが容易にするために、90 sのプラズマで表面を処理します。 ウエハーの中央に約3mLのSU-8レジストを注ぎ、SU-8を所望の厚さに下げるスピンコートをします(図1A)。50 μmの公称厚さでは、SU-8 3050とスピンコートを500rpmで10s、3500 rpmで30sを連続して使用します。樹脂に含まれる溶媒を蒸発させてフォトマスクに貼り付けないようにして部分的に固化させるために、368Kで15分間ホットプレート上でフォトレジストをソフトベークします。その後、2分間室温でウエハーを残します。 フォトレジストをUV光に当てる(図1B)。35 mWcm-2 と 8 s 露光時間のパワーを持つマスク アライナーを使用します。 露光後のベーキングを続行します。368 K で 5 分間ホットプレートにウエハーを置き、UV 露光によって呼び出される光反応を完了します。 プロピレングリコールメチルエーテルアセテート(PGMEA)を含む浴槽にウエハーを入れて架橋しなかったSU-8レジストをすべて取り除き、15分間撹拌します。ぼやけた沈殿が見られないまでイソプロパノールでウエハをすすいすいます。ウェハを窒素ガスで乾燥させ、ペトリ皿(100mm x 15mm標準サイズ)に保管してください。 2つのスタンプを作製するために使用されるポリジメチルシロキサン(PDMS)の剥離を容易にするために、シランでウエハーの表面を扱います。368 K のホットプレートにウエハーを 10 分間、ヘキサメチルジシルラザン (HMDS) の蒸気雰囲気下で 10 分間蒸着します。注:ウエハからPDMSを剥がすのが困難な場合は、ウエハの表面をHMDS蒸気で再処理する必要があります。 チャネルと柱を含む最初のマスターが準備完了です。これらの手順を繰り返し、2 番目のマスターが柱のみをパターン化する準備をします。メモ:フォトリソグラフィの目的は、SU-8マスター上のデバイスの形状を50μmの高さで取得することです。ただし、2 つの SU-8 マスターが製造されたら、実験値を取得するためにプロフィロメーターを使用してマスターに刻まれたジオメトリの高さを測定します。このプロトコル用に製造された両方のSU-8マスターの測定値は約45μmです。 2. PDMS金型製作 注:プロトコルの次の手順は、積層フローフードを使用している限り、部屋の黄色の光がNOA 81樹脂(ステップ3.6-3.11)を使用する場合に使用され、UV光のソースは、NOA 81樹脂を重合するために利用可能である(ステップ3.7と3.11)、任意の研究室で行うことができます。 50gのPDMSシリコーンベースとその硬化剤を10:1質量比で調製します。 ビーカーの両方の成分をヘラと混ぜ、真空チャンバーに入れてすべての気泡を取り除きます。 25 gのプレミックス PDMS を SU-8 マスターに注ぎ、チャネルと柱を約 5 mm の高さまでパターニングします。PDMS の残りの 25 g を、約 5 mm の高さまで柱のみをパターニングする 2 番目の SU-8 マスターに注ぎます (図 1C)。 両方のペトリ皿をオーブンに入れ、PDMS層を338 Kで1時間硬化させます。 硬化したPDMS層をメスでSU-8マスターのパターンの周りに切り、マスターからPDMS金型をそっと剥がします(図1D)。注:レプリカ成形と呼ばれる上記の手順は、ガラス表面に取り付けられ、マイクロ流体デバイス53の一部となるPDMSの金型を調製するために頻繁に使用されている。このプロトコルでは、PDMS 金型はチップの一部ではありませんが、チップ製造の中間体として使用されます。各設計に対して、2つのPDMS金型がそれぞれのSU-8マスター(図1Dおよび1E)から調製され、マイクロチップの製造に応じて(下記に説明する)使用されます。 3. 透析チップ製造 PDMS モールド パターニングは、硬質顕微鏡のガラス スライド (3 x 1 in. 標準サイズ) 上向きのパターンを使用して、チャネルとピラーの両方を上向きに配置します (図 1F)。タンパク質貯留層に対応する中央柱は、PDMS金型の水平面から垂直に45μmを超えています。 再生セルロース(RC)透析膜の乾燥片を切って分離し、ガラススライドに支持されているPDMSモールドの中央柱に堆積する(図1F)。注:RC透析膜は市販されており、それに応じて分子量カットオフ(MWCO)が、研究対象のタンパク質の分子量と使用される沈殿物に応じて選択されます。RC透析膜の部分のサイズは、チップの設計に依存します。このプロトコルでは、タンパク質貯留層の容積が0.1または0.3μLである2つのプロトタイプが設計されている。これらの場合、透析膜片のサイズはそれぞれ2 x2mm2 または4 x 4 mm2である。 ガラススライドに対応するPDMSモールドの上に下向きの柱のみをパターン化して第2のPDMSモールドを配置します(図1F)。この金型の中央柱はタンパク質貯留層に対応し、水平面から45μmの垂直(下向き)を超えます。 2 つの PDMS 金型の中央柱を位置合わせします。RC透析膜は、2つのPDMS型の間に「挟まれる」(図1G)。注: 2 つの PDMS 金型のマイクロ構造間の位置合わせは、余分な装置なしで視覚的に実現できます。それ以外の場合、この操作は顕微鏡で達成することができます。流動路と入力または出力ポイントが完全にカバーされていない限り、貯水池間の小さなシフトは問題ありません。 PDMS金型内の閉じ込められた気泡をすべて除去し、製造の次のステップ中に樹脂の挿入を促進するために、真空チャンバーで30分間アセンブリを乾燥させます。注:2つのPDMS金型はPDMS-PDMS接着によって所定の位置に保たれ、余分な圧力またはその他の一時的な接合方法は必要ありません。 2つのPDMS金型間の空きスペースを、毛細管インビビジョンで光硬化性のチオレイン系樹脂NOA 81で埋める(図1Hおよび1I)。 コリメートUVランプ(パワー35mWcm-2)を用いて8sのUV光(365nm)に曝露して樹脂を硬化させる。注: この最初の露出は、両側のPDMS金型に接触するNOA 81の薄い層が未硬化のままであるため、NOA 81樹脂を部分的に架橋することができます。 PDMS金型の外部側面から、NOA 81の過剰をメスで切ります。 下部のPDMS金型とガラススライドから部分的に架橋されたNOA 81が貼り付けられた上部PDMSモールドを取り外します。 顕微鏡用ガラススライド(3 x 1インチ)の標準寸法で厚さ175μmのPMMAシートを切り取り、PMMAピースの両側からプラスチック保護シートを剥がします。上部PDMS金型のアセンブリと、部分的に硬化したNOA 81をPMMAピースにそっと押し込みます(図1J)。 60sのUV光に曝露して再びNOA 81を硬化させ、上部PDMS型を取り除く(図1K)。樹脂は、それ以上の処理を行うことなくPMMA基板に付着する。注:PDMS金型は、イソプロパノールとアセトンで洗浄した後、金型が曲がっていない限り、約5回まで再利用することができます。RC透析膜はNOA 81のステッカーに組み込まれ、それ以上の操作または機械的なクランプは必要とされない。 4. 流体コネクタ 注:マイクロ流体チップの設計は、結晶化溶液用の線形流体チャネルとタンパク質サンプル(タンパク質リザーバー)の中央リザーバから構成され、いずれも 図2Aの2つのマイクロチップの上図から示されている。RC透析膜はこれら2つの微細構造(図2D)の間に埋め込まれ、結晶化プロセスは、結晶化溶液からの沈殿物が膜を横切って拡散しながら進化し、膜によって分離されたチップの2つの区画間の濃度勾配によって広がる。マイクロ流体チャネルは、下部PDMSモールド(図1F)に刻印される。チップの製造プロトコルが完成すると、図 1Kに示すように、線状チャネルは、PMMA基板と接触するNOA 81ステッカーの底層に位置する。結晶化溶液の入口と出口アクセスポイントは、線形チャネルの両端に位置し、 図2Aに示すように穴(全高さ90μm)のように見えます。結晶化液の取り扱いのためには、アクセスポイントにコネクタを追加する必要があります。 高速エポキシ接着剤を用いたマイクロ流体チャネルの入口および出口に市販されている結合コネクタ(NanoPort) コネクタのサイズに基づいて PTFE チューブの適切な直径を選択します。PTFEチューブは、チップの流動流路における結晶化溶液の導入に使用されます。注:市販のキットは流量を容易かつ正確に制御するために推奨され、通常は混合および流体処理のための自動化された圧力駆動または流動制御(シリンジポンプ)システムと組み合わされる。しかし、結晶化溶液は、使い捨てプラスチックシリンジを用いてリニアチャネルに手動で導入することができる。この場合、手順 4.3 ~ 4.5 が推奨されます。 1 mL の使い捨てのシリンジに結晶化液を充填します。このプロトコルで提示されるチップの場合、400 μL で流動チャネル全体を満たします。 片方の先端の直径が、溶液の取り扱いに使用されるPTFEチューブの内径と等しくなるように、2つのピペットチップをカットします。チャンネルのアクセス ポイントに、切り抜いたヒントを高速エポキシグルーで接着します(図 2B)。 適切なサイズのPTFEチューブの一部と切り抜かれた先端とシリンジを接続し、常にゆっくりとシリンジプランジャーを押すことによって、チャネル内のソリューションを導入します。 5. タンパク質カプセル化 注:タンパク質貯蔵所として使用されるチップのパターンは、これまでのところ大気に開いたままです。以下のプロトコルは、タンパク質サンプルをマイクロ流体チップ内に慎重に閉じ込めるために提案される。 図2Eに示すように、RC透析膜の真上に位置するタンパク質貯蔵所の内部にタンパク質サンプルの液滴を手動でピペット。タンパク質サンプルの容量はチップの設計によって異なり、0.1 μLまたは0.3 μLになります。 タンパク質貯留層の周りに高真空シリコーングリースの薄い層を塗布します。 厚さ175μmのPMMAシートの小片を切り、シリコーングリースの薄い層の上にそっと置きます。PMMAの部分は、タンパク質溶液が沈着するタンパク質貯留層の表面全体を覆わなければならない。注:シリコーングリースは気密性を高め、タンパク質の液滴の拡散を防ぐために使用されます。タンパク質貯留層とNOA 81ステッカーをカバーするために使用されるPMMAピース間の結合またはシールはありません。それらの間の接触は固体/固体の界面である。タンパク質サンプルの全体的なシールおよび気密封入を生成するために、ステップ5.4に記載されているようにカプトンテープの一部が使用される。注:流体チャネル内の結晶化溶液の導入に圧力駆動系を使用する場合、デバイスの専用の空洞(タンパク質貯留層)内にタンパク質サンプルを閉じ込めるのが困難な場合があります(ステップ6.4)。上記の問題を回避するために、結晶化液を循環しながら比較的低い圧力値を維持すべきである。より粘性溶液(PEGs、グリセロール)の水溶液用20〜60mbarまたは50〜150mbarの注入圧力が示唆される。 タンパク質貯留層の上に設定されたPMMAピースを覆い、すべてのエッジの周りにNOAチップに貼り付けるのに十分な大きさのカプトンテープ(厚さ20μm)をカットします。タンパク質サンプルはリザーバ内にカプセル化され、 チップは、図2Cに示すように、結晶化実験に使用する準備ができています。注:チップは、透析膜とPMMA基板上のNOAの接着が劣化していない限り、数回再利用することができます。チップのこれらの部分が破損している場合、デバイスが使用できなくなったことを確認するリークが発生します。チップを洗浄する場合は、結晶化液に依存します。低粘度溶液(塩、緩衝液)の場合、流体チャネルは蒸留水を導入するだけで洗浄し、数分間流し込むことができます。400 μL は、チャネル内のソリューションを別のソリューションと完全に交換するために必要なボリュームです。より粘性溶液(PEGs、グリセロール)の場合、水だけでチャネルを洗浄するだけでは十分でないため、チップの再利用は推奨されません。チップの上部は、タンパク質貯蔵所が位置し、蒸留水で洗浄し、加圧空気で乾燥させることもできます。 6. オンチップタンパク質の結晶化 凍結乾燥した鶏卵白溶解酵素粉末を秤量し、蒸留水に溶解して30mgmL-1の最終濃度を得た。 0.22 μmのフィルターと遠心分離機を通して、293 Kで最高速度で 5 分間タンパク質溶液をフィルター処理し、すべての固体粒子を除去します。結晶化実験には上清を使用します。 バッファーと沈殿物を含む500 μLの結晶化溶液を 表1に設けた濃度で調製する。0.22 μmフィルターを使用して、溶液をフィルター処理します。 ステップ 4.1 から 4.5 で説明されているように、シリンジまたは自動圧力駆動の流体システムまたはシリンジ ポンプを使用して、チップの入口点に溶液を注入します。注: 結晶化実験は、マイクロ流体チャネルが結晶化溶液で満たされ、一定の流量でチャネル内に連続的に注入される場合、流れる条件下で、静的な条件下で発生する可能性があります。後者の場合は、外圧駆動システムまたはシリンジポンプの使用をお勧めします。流動条件下での実験の実現は、流体チャネル内で結晶化溶液を動的に交換する可能性も提供する。これにより、同じタンパク質サンプルを用いた間に複数の実験を行うことができる。 流体チャネルに結晶化液が充填されたら、チップの入口ポートと出口ポートをパラフィルムテープで密封します。 タンパク質貯留層内のタンパク質溶液の適切な容積をピペットし、ステップ5.1〜5.4に記載されているようにタンパク質サンプルを封入する。 チップは293 Kで保管してください。注:透析による結晶化は、蒸気拡散法やバッチ結晶化で行われた実験とは異なる運動軌道に従い、拡散プロセスに関与する沈殿分子の性質に大きく依存し、測定データ51によれば、核形成が開始するにはより多くの時間がかかる可能性がある。蒸発を防ぐために、もしあるならば、この期間中、293Kの湿気飽和雰囲気の中にチップを置く。 7. オンチチュ およびオンチップX線回折 ビームラインの3Dプリントサポート 最大3チップを同時に運ぶことができるサポートを印刷します。支持体の寸法は、プレートX線回折実験で互換性のある市販の結晶板(96ウェル/SBS標準)の寸法と同じです。注: サポートの印刷は、商用サービスに割り当てることができます。このサポートは、3D-CAD設計ソフトウェアを使用して設計され、オンチップタンパク質結晶化実験中の図3Aと、BM30A-FIP(ESRF)でのX線回折データ収集中の図3Bに示されています。 単一または両面テープでサポート上の透析チップを安定させる。 その時 X線回折 タンパク質貯留層で成長した結晶から室温でX線回折データを収集します。たとえば、エネルギー 12.656 keV、3.32 x 1010 フォ トン s-1 のフラックス、ビーム サイズ 250 x 250 μm2の X 線を使用します。315 x 315 mm2 および 9.4 メガピクセル解像度のアクティブサーフェスの 3 x 3 CCD のマトリックスを持つ ADSC Quantum 315r 検出器を使用して回折画像を記録します。注:透析チップで成長したリソチーム結晶の回折データは、欧州放射光施設(ESRF)のBM30A-FIPビームラインで収集されました。しかし、ビームサイズ、フラックスおよび検出器タイプは、他のX線放射源において異なっていてもよい。3Dプリントのサポートは、結晶の周りに-40°から+40°の角度範囲でデータ収集を可能にします。その 場で のデータ収集のために露出したリソチーム結晶の数、各結晶について収集された回折パターンの数、露光当たりの振動角範囲および露光時間を 表2にまとめた。 データ処理 XDSプログラム48を使用して、リソチーム結晶の回折パターンを使用して完全または部分的なデータセットを処理します。 各データセットのHKLファイルを生成し、XSCALEソフトウェア48を使用してそれらをスケーリングします。 CPP4スイート49 のプログラムPhaserで分子置換を使用し、モデル構築のフェーズを決定します。このステップでは、タンパク質データバンク(PDB)エントリ193Lからリソザイムの既知の3D座標を使用します。 Phenix52 を使用して構造を改良し、最終的なタンパク質モデルを COOT50を使用して検査します。