נייר זה מפרט את פרוטוקול הייצור של שבבים מיקרופלואידיים שפותחו להתגבשות חלבונים על שבב בשיטת הדיאליזה ובניסויי עקיפת קרני רנטגן. תהליך microfabrication מאפשר לשלב קרום דיאליזה תאית מתחדשת למחצה עם כל משקל מולקולרי מנותק, בין שתי שכבות של השבב.
פרוטוקול זה מתאר את הייצור של מכשירים מיקרופלואידיים הניתנים לשחזור וזול המכסים את כל הצינור לצורך התגבשות חלבונים על השבב בשיטת הדיאליזה ומתן אפשרות בניסויים בקריסטל יחיד או קריסטלוגרפיה סדרתית בטמפרטורת החדר. הפרוטוקול מפרט את תהליך הייצור של השבבים, את המניפולציה של ניסויי התגבשות על השבב ואת הטיפול באתרו אסף נתוני עקיפת רנטגן עבור ההבהרה המבנית של דגימת החלבון. התכונה העיקרית של הליך microfabrication זה טמון על שילוב של מסחרי זמין, קרום דיאליזה תאית מתחדשת למחצה בין שתי שכבות של השבב. המשקל המולקולרי של הממברנה המוטבעת משתנה בהתאם למשקל המולקולרי של המקרומולקולה והמשקעים. המכשיר מנצל את היתרונות של טכנולוגיה מיקרופלואידית, כגון שימוש בכמויות זעירות של דגימות (<1 μL) וכוונון עדין על תופעות תחבורה. השבב צירף אותם לשיטת הדיאליזה, המספקת שליטה מדויקת והפיכה על תהליך ההתגבשות וניתן להשתמש בה לבדיקת דיאגרמות פאזה של חלבונים בסולם המיקרוליטר. המכשיר מעוצב באמצעות שרף מבוסס ת'יולן פוטו-קורלן עם ליתוגרפיה של הטבעה רכה על מצע פולימרי שקוף אופטית. יתר על כן, פיזור הרקע של החומרים המרכיבים את השבבים ויצירת רעשי רקע הוערך מה שהופכים את השבב תואם בניסויי עקיפת קרני רנטגן. ברגע שגבישי חלבון גדלים על שבב עד לגודל הולם ואחידות אוכלוסין, השבבים יכולים להיות מותקנים ישירות מול קרן הרנטגן בעזרת מחזיק מודפס בתלת-ממד. גישה זו מטפלת באתגרים העולים משימוש בהקפאה וקצירה ידנית בניסויי קריסטלוגרפיה קונבנציונליים של חלבונים באופן קל וזול. ערכות נתונים מלאות של עקיפת קרני רנטגן מגבישי ליזוזים איסומורפיים מרובים הגדלים על שבב נאספו בטמפרטורת החדר לצורך קביעת מבנה.
הבהרת המבנה התלת מימדי (3D) של מקרומולקולות ביולוגיות היא מרדף בלתי פוסק בביולוגיה מבנית שבה קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן נותרה טכניקת החקירה העיקרית. היא ביקשה לפענח את הפרטים המבניים של מקרומולקולות מורכבות, כגון חלבונים, במטרה להקל על הבנת מנגנוני הפעולות שלהם ומעורבותם בתפקודים ביולוגיים שונים. מקורות רנטגן רבי עוצמה בלייזרים נטולי סינכרונים ורנטגן (XFELs) מספקים את כל הכלים הדרושים לתובנה מעמיקה יותר על מבנה החלבונים ברזולוציה אטומית קרובה. למרות היתרונות שמגיעים יחד עם השימוש בצילומי רנטגן למחקרים מבניים, קיימות מגבלות מהותיות לקרינת רנטגן ולתהליך ההתגבשות עצמו. נזק לקרינה שנגרם על ידי שטף רנטגן גבוה וזמני חשיפה ארוכים של גביש החלבון מול קרן הרנטגן הם פרמטרים מגבילים כי crystallographers צריך לעלות באמצעות קירור קריוגני1. עם זאת, מציאת תנאי ההקפאה האופטימליים יכולה להיות מייגעת שכן שינויים קונפורמיים ממבנה החלבון המקומי או חפצים ניתן להסתיר2,3. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה מצביעים על כך ביצוע ניסויים עקיפה בטמפרטורת החדר מוביל נזק קרינה ספציפי נמוךיותר 4. צוואר בקבוק נוסף בביולוגיה מבנית הוא רכישת גבישים מפוזרים היטב בגודל מספיק5. גבישים קטנים קלים יותר לייצור, במיוחד במקרה של חלבוני ממברנה, אך רגישים יותר לנזקי קרינה גם בתנאי cryocooling מכיוון שמינוןקרינהגבוה חייב להיות מופנה בנפח קטן יותר בהשוואה למקרה של גבישי חלבון גדולים יותר 6 . הגישה החדשה של קריסטלוגרפיה סדרתית7,8 ב synchrotrons ו XFELs יכול לעקוף את הריסונים של נזקי קרינה באותו זמן לנצל גבישים קטנים יותר (200 ננומטר עד 2 מיקרומטר)7 על ידי מיזוג ערכות נתונים ממספר, גבישי חלבון איזומורפיים ומכוונים באופן אקראי ומרוויחים מההתקדמות הטכנולוגית הנלווית כגון פולסים femtosecond, זמני חשיפה קצרים יותר וקרני רנטגן ממוקדות מיקרו5,7,9,10.
טכנולוגיה מיקרופלואידית היא בעלת ערך לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, ומציגה יתרונות רבים להתגבשות מקרומולקולות ביולוגיות ולחקירה המבנית שלהן. ביצוע ניסויי התגבשות במכשירים מיקרופלואידיים דורש כמויות קטנות של דגימת חלבון, ובכך מגביל את עלות הייצור של מקרומולקולות ביו בעלות ערך גבוה אלה ומאפשר סינון תפוקה גבוהה ואופטימיזציה של תנאי התגבשות רבים. יתר על כן, יחס שטח הפנים הגדול הטבוע בנפח בקנה מידה מיקרופלואידי ותופעות תחבורה מוגבלות דיפוזיה מאפשרים שליטה עדינה על זרימות וטמפרטורה או שיפוע ריכוז11,12,13,14, עיבוד התקנים מיקרופלואידיים המתאימים לגידול גבישים בגודל אחיד ולחקור דיאגרמות שלב15,16,17,18,19. יתר על כן, כלים מיקרופלואידיים מציגים פוטנציאל ייחודי להתמודד עם משוכה נוספת בקריסטלוגרפיה של חלבונים, שהיא משלוח הדגימה, והצורך לטפל ולקצור גבישי חלבון לפני השימוש בהם לניסויי עקיפת קרני רנטגן. שיטת השבב ובקריסטלוגרפיית רנטגן situ מבטלת את מניפולציית הגביש ואת ההידרדרות הפוטנציאלית של איכות הגביש לפני איסוף הנתונים. מגוון רחב של שבבים מיקרופלואידיים התואמים לקריסטלוגרפיה של חלבון רנטגן situ תוכננו, פותחו ונבדקו על ידי קבוצות מחקר רבות המתמודדות עם המגבלות הקשורות הנובעות מאופי חומרי המיקרו-פבריקציה והאינטראקציות שלהם עם צילומי רנטגן14,19,20,21,22,23. חומרי הייצור חייבים להיות שקופים אופטית, אינרטיים ביולוגית ולהפגין שקיפות גבוהה לקרינת רנטגן ויחס אות לרעש אופטימלי במהלך איסוף הנתונים.
רוב שיטות ההתגבשות המיושמות בקריסטלוגרפיה קונבנציונלית של חלבונים24,25 יושמו גם בסולם המיקרופלואידי11,14 להתגבשות שבבים ובניתוח עקיפת קרני רנטגן. מנגנון מיקרופלואידי פשוט, היברידי או רב שכבתי המשלב דיפוזיה אדים26, אידוי27, דיפוזיה ממשק חינם (FID)28, microbatch26, או אפילו זריעה29 שימשו כדי לגבש חלבונים מסיסים קרום. סינון תפוקה גבוהה ואופטימיזציה של תנאי התגבשות ניתן להשיג30,31 ב מבוסס היטב32, droplet מבוסס33, או שסתום מופעל34 התקנים. במקום ניסויי עקיפת קרני רנטגן של מטרות חלבון מאתגרות בטמפרטורת החדר נערכו בשבבים מפוברק מחומרים שונים כגון PDMS (polydimethylsiloxane), COC (קופולימר אולפין מחזורי), PMMA (פולי (מתיל methacrylate))21,22,26,28,29, גרפן סרטים23, Kapton35, דבק אפוקסי6, או NOA (דבק אופטי נורלנד)19 ואת השקיפות של החומרים קרינת רנטגן ותרומתם לרעשי רקע הוערכו. יתר על כן, שבבים תוכננו כדי זוג in situ ואת אסטרטגיות איסוף נתונים סדרתיים בכלי אחד עבור ניסויים קריסטלוגרפיה חלבון רנטגן במקורות synchrotron23,35,36 ו XFELs7.
טמפרטורת החדר באיסוף נתוני situ יושמה גם בשיטות אספקה ומכשירים שונים. לדוגמה, Nogly et al.54 השתמשו במזרק שלב מעוקב ליפידי (LCP) כדי לחקור את המבנה של בקטריאורודופסין משאבת פוטון מונחה אור (bR) על ידי קריסטלוגרפיה femtosecond סדרתי (SFX) באמצעות מקור XFEL. מבנה הגביש של bR נפתר לרזולוציה של 2.3 Å, הממחישה את תאימותו של מזרק LCP עם קריסטלוגרפיה סדרתית שנפתרה בזמן (TR-SFX). בקסטר ואח ‘55 עיצב רשת מרובת גבישים בצפיפות גבוהה, מפוברק על ידי פלסטיק פוליקרבונט בעובי 100 או 200 מיקרומטר עם חורים חתוכים בלייזר בגדלים שונים. סרט פוליקרבונט נוסף בעובי 5 מיקרומטר ניתן לתקן לצד אחד של הרשת בעת שימוש במכשיר לניסויי התגבשות ישיבה או תלייה. רשת זו בצפיפות גבוהה ניתן להשתמש בדרכים רבות כמו גבישים ניתן לטעון ישירות על היציאות של המכשיר או גבישים ניתן לגדל על המכשיר על ידי דיפוזיה אדים או שיטת LCP. יתר על כן, הרשת יכולה להיות מותאמת בבסיס מגנטי סטנדרטי ומשמש באיסוף נתוני רנטגן situ בתנאים קריוגניים או טמפרטורת החדר. לאחרונה, Feiler et al.56 פיתחה מחזיק מדגם עבור מקרומולקולרי בקריסטלוגרפיה רנטגן situ בטמפרטורה קריוגנית והסביבה עם תרומה מינימלית רעש רקע. באופן ספציפי, המחזיק מורכב מתמיכה בפלסטיק, רדיד COC שקוף ונייר פולימיד מיקרופורי מובנה. הוא תוכנן להחליף את שקופיות הכיסוי הנפוצות להגדרת טיפות התגבשות, תוך מתן אפשרות למניפולציה במקום כגון השריית ליגנד, היווצרות מורכבת והגנה קריוגנית מבלי לפתוח את טיפת ההתגבשות או לטפל באופן ידני בגבישים. יתר על כן, מחזיק המדגם ניתן להסיר מלוח התגבשות והניח על בסיס מגנטי עבור באיסוף נתונים situ בקורות מבוססות goniometer סטנדרטי. לאיסוף נתוני טמפרטורת הסביבה, רדיד COC מוסר לפני הניסוי ורק רדיד פולימיד בעובי 21 מיקרומטר תורם לפיזור רקע, שבמקרה זה הוא מינימלי. דוגמאות אלה להלחין רק חלק קטן של המחקר המתמשך ואת שפע של שבבים רב תכליתי שפותחו עבור קריסטלוגרפיה חלבון רנטגן.
עם זאת, שיטת התגבשות חלבון הדיאליזה לא שולבה באופן נרחב בתוך microfluidics. דיאליזה היא שיטה מבוססת דיפוזיה שמטרתה שיווי משקל של ריכוז משקעים באמצעות קרום חדיר למחצה על מנת להתקרב לריכוז הנומינלי להתגבשות חלבונים ומאפשרת שליטה מדויקת והפית הפיכה על תנאי התגבשות24. ניתן לבחור את המשקל המולקולרי (MWCO) של קרום הדיאליזה החודר למחצה בהתאם למשקל המולקולרי של המקרומולקולה והמשקעים כדי לאפשר פיזור של מולקולות משקעים קטנות תוך שמירה על המקרומולקולה של העניין. בשל היפוך תהליך הדיאליזה, ניתן להשתמש בו בשילוב עם בקרת טמפרטורה כדי לנתק ולמטב את הגרעין ואת צמיחת הגביש באופן עצמאי37 לחקירת דיאגרמות שלב על ידי שינוי ריכוז המשקעים תוך שימוש באותה דגימת חלבון. שילוב של ממברנות microfluidics נבדק על ידי דה יונג ואח’38 ואת המקרים במחקרים ביולוגיים השתלת דיאליזה לתוך שבבים יכול להיות רשום בעיקר בהכנה מדגם, ריכוז או סינון יישומים39,40,41,42 או תא הקשורים מחקרים43,44. החדירה באמצעות PDMS שימשה את Shim et al.37 כדי לחקור את הגרעין והצמיחה של קסילנאז בתנאים שונים. מים חלחלו דרך קרום PDMS בעובי 15 מיקרומטר לתוך מאגר החלבון של המכשיר המיקרופלואידי, ולאחר מכן שינו את ריכוז החלבון והמשקעים.
הפרוטוקול שפותח על ידי Junius et al.19,45 לייצור שבב microfluidic תואם הן על השבב התגבשות חלבון באמצעות מיקרודיאליזה והן באתרו רנטגן עקיפה ניסויים בטמפרטורת החדר מוצג. הפרוטוקול לייצור המכשיר הוא בהשראת העבודה החלוצית שהושגה על ידי Studer ועמיתים לעבודה12,46 עבור מדבקות מיקרו בדוגמת של שרף מבוסס תיולן צילום NOA 81 הטמעה ממברנות זמינות מסחרית, באמצעות ליתוגרפיה חותם רך. שינוי חדשני של השיטה הביא שבבים המאפשרים שימוש במיקרודיאליזה כדי לנטר ולשלוט במדויק בפרמטרים הניסיוניים לצמיחה על השבב של גבישי חלבון ובו זמנית לנצל את היתרונות של microfluidics, כגון צריכה מופחתת של דגימות חלבון לכל ניסוי ( 20 μL) עבור סינון ואופטימיזציה של תנאי התגבשות על ידי מיפוי דיאגרמות שלב ריכוז משקע טמפרטורה הודגמו47. בעבודה זו מתואר פרוטוקול לייצור שבבי דיאליזה המשלבים קרום דיאליזה תאית (RC) של MWCO שונים על מנת לבצע מבחני התגבשות על השבב ובאיסוף נתונים עקיפת קרני רנטגן. החומרים המרכיבים את השבבים הוערכו על השקיפות שלהם לצילומי רנטגן19 וניתן להגדיר את המכשירים ישירות מול קרן הרנטגן לטמפרטורת החדר בניסויי עקיפת situ, למעט הטיפול הידני ומזעור ההשפלה של גבישי חלבון שבירים. במחקר מקרה, גבישי lysozyme לבן ביצה תרנגולת גדלו על שבב באמצעות מיקרודיאליזה יצירת אוכלוסייה בגודל אחיד. השבב הורכב אז מול קרן הרנטגן עם תמיכה3D מודפס 19 והושלם בערכות נתונים עקיפה situ נאספו בטמפרטורת החדר מגבישים מרובים, isomorphous, המדגים את הפוטנציאל הגבוה ואת הרלוונטיות של השבבים למחקרים קריסטלוגרפיה סדרתית סינכרוטרון של מטרות מקרמולקולריות מאתגרות.
מכשיר מיקרופלואידי פותח להתגבשות חלבונים על שבב בשיטת המיקרו-דיאליזה ובניסויי עקיפת קרני רנטגן במקום בטמפרטורת החדר. שבבי NOA 81 המשלבים ממברנות דיאליזה של RC של כל MWCO על מנת להשתמש במיקרו-דיאליזה להתגבשות חלבונים על השבב יכולים להיות מפוברקים. נעשה שימוש בחומרי ייצור בעלי שקיפות גבוהה יחסית של קרני רנטגן, מה שהפך את השבבים לתואמים לקריסטלוגרפיה של חלבון situ. חומרי הייצור המרכיבים את התא להתגבשות חלבונים של המכשיר (PMMA, Kapton, קרום דיאליזה RC) הוערכו כדי ליצור רעשי רקע נמוכים. באופן ספציפי, רעש הרקע שנוצר על ידי שבב הדיאליזה נצפתה בעיקר ברזולוציה נמוכה (> 6 Å) ואינה משפיעה על הטיפול בנתוני עקיפה ברזולוציה גבוהה של גבישי lysozyme הגדולים הנדרשים לקביעת מבנה החלבון. האוטומציה של איסוף הנתונים מוגברת באמצעות תמיכה מודפסת בתלת-ממד שניתן להתקין ישירות בקרני קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית ולשאת עד שלושה שבבים בו-זמנית. בדרך זו, קציר ידני ומניפולציה של גבישי חלבון שביר נמנע. יתר על כן, איסוף הנתונים מתרחש בטמפרטורת החדר, הימנעות הצורך cryoprotection אשר יכול להיות קשור לשינויים קונפורמיים ממבנה החלבון המקומי2,3.
השימוש במיקרו-דיאליזה כשיטה לגידול גבישים על השבב מאפשר לנטר ולשלוט במדויק בתהליך ההתגבשות. כפי שנדון בהקדמה, רוב שיטות התגבשות החלבון הקונבנציונליות יושמו באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים11,14. עם זאת, היתרונות של דיאליזה להתגבשות חלבון עדיין לא נוצלו במלואם במיקרומטרי. מיקרודיאליזה על השבב מספקת את האפשרות ללמוד דיאגרמות שלב ולבצע סינון ואופטימיזציה של תנאי התגבשות עם אותה דגימת חלבון19. עבור אבות הטיפוס המוצגים בעבודה זו, צריכת החלבון לכל שבב מוגבלת עד 0.1 או 0.3 μL. בהתבסס על העבודה הניסיונית עד כה, השלבים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול אינם נובעים מהליך הייצור של השבבים אלא מתהליך ההתגבשות. פרוטוקול הייצור כולל שלבים רבים אך הוא פשוט ומאפשר ייצור של מכשירים רבים (20 עד 30 שבבים) ביום אחד בחדר הנקי, עם חומרים זולים יחסית. עם זאת, התגבשות על השבב של חלבונים יכולה להיות הליך עדין בשל האופי הסטוקסטי המהותי של התגרענות וצמיחת הגביש, במיוחד במיקרומטרי. מקרה מבחן תואר, שבו תנאים מבוססים שימשו להתגבשות של lysozyme שהניב חזק, גבישים מוגדרים היטב מתאים באיסוף נתונים עקיפת רנטגן situ. עם זאת, קשיים עשויים להתעורר על ידי שימוש ביעדי חלבון מאתגרים יותר, כגון חלבוני ממברנה, שבהם מדיום ההתגבשות הרבה יותר מסובך, דיאגרמות פאזה אינן ידועות ותנאי התגבשות עובדים היטב עדיין אינם מבוססים היטב. שבב הדיאליזה מציע את האפשרות להתעלות על קשיים אלה וללמוד דיאגרמות שלב על השבב, מבלי להיפטר מדגם החלבון היקר ולעתים קרובות יקר, על ידי החלפת פתרון התגבשות בתוך הערוץ microfluidic.
הרבגוניות של המכשירים המיקרופלואידיים נובעת מניצול מיקרו-דיאליזה להתגבשות חלבונים על-שבב כדי לשלוט באופן הפיך בתנאי התגבשות ולמפות דיאגרמות שלב מגוונות של ריכוז וטמפרטורה באמצעות נפח חלבון נמוך. יתר על כן, המכשיר תואם בניסויים עקיפת רנטגן situ ואת אב טיפוס של המכשירים הוא זול ומהיר. ניתן לגדל על השבב גבישים איסומורפיים רבים של חלבונים מסיסים וממברנה (כהכנה) וצפויים להשתמש בכל התכונות הללו למחקרי קריסטלוגרפיה סדרתיים של קרני רנטגן של מטרות חלבון מאתגרות במתקני סינכרוטרון ו- XFEL. לבסוף, ביצוע על שבב ובמחקרים שנפתרו בזמן situ היא אפשרות עתידית שיכולה להיות עניין משמעותי לקהילה הקריסטלוגרפית. לכן, על ידי גידול גבישים על שבב הדיאליזה והכנסת ריאגנטים לתוך הערוץ המיקרופלואידי, או באופן ידני (באמצעות מזרק) או באופן אוטומטי (עם מערכת נוזל בקרת לחץ או משאבת מזרק), המאמצים העתידיים יתמקדו להוכיח כי השבבים microfluidic ניתן להשתמש בהצלחה כדי להפעיל ניסויים שנפתרו בזמן על קרני synchrotron.
The authors have nothing to disclose.
MBS מכיר בתמיכת ה-MI / CNRS במסגרת ההתקשרות מכשור במגבלות 2014-2015. ניו ג’רזי מכירה בתוכנית הבינלאומית לחקר הדוקטורט (Irtelis) של CEA עבור מלגת הדוקטורט. MBS ו-SJ מאשרים מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק מארי סקלודובסקי-קירי מספר 722687. MBS, SJ ו- NJ מודים ל- LIPhy (UGA) על הקמת החדר הנקי לניסויים במיקרו-פשיון. IBS מכיר בהשתלבות במכון המחקר הבינתחומי של גרנובל (IRIG, CEA).
3 in wafer | Silicon Materials Inc. | Silicon wafer | |
Centrifuge | Eppendorf | Minispin | Bench-top centrifuge |
CleWin 3.0 | WieWeb software | Designing software | |
Epoxy glue | Devcon | 5 minutes epoxy glue | |
Fluidic connectors | Cluzeau Info Lab | N-333 | NanoPort kit for 1/16" OD tubing |
Hen egg-white lysozyme | Roche | 10 837 059 001 | Lyophilized protein powder |
High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | Dow Corning high-vacuum silicone grease |
HMDS | Sigma-Aldrich | 440191 | Silane, chemical |
Hot plate | Sawatec | HP-200-Z-HMDS BM | Hot plate |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | Solvent | |
Kapton tape | DuPont | Polyimide tape | |
Mask aligner | SUSS MicroTec | MJB4 | Mask aligner, UV source |
Membrane filter | Millipore | GSWP04700 | 0.22 μm pore size filter |
Microscope glass slide | Fisher Scientific | 12164682 | 3 x 1 in glass slides |
NOA81 | Norland Products Inc. | NOA81 | Photocurable resin |
Oven | Memmert | Oven | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft |
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone |
PEG 400 | Hampton Research | HR2-603 | Chemical |
Petri dish | Sigma-Aldrich | P5731 | 100 x 15 mm |
PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | Developer |
Plasma equipment | Diener Electronic | ZEPTO | Plasma treatment |
PMMA | Goodfellow | 137-745-63 | PMMA sheets 150×150 mm, 0.175 mm thickness |
Pressure driven system | Elveflow | OB1 MK3+ | Pressure/vacuum controller |
PTFE tubing | Elveflow/Darwin microfluidics | LVF-KTU-15 | PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID |
RC dialysis membrane | Spectra/Por | Various MWCOs | |
Scalpel | Swann-Morton | Carbon steel surgical blades | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Chemical |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | Chemical |
Solidworks | Dassault Systemes | 3D-CAD designing software | |
Spin coater | SPS | Spin150 | Wafer spinner |
SU-8 3000 series | MicroChem Corp. | SU-8 3050 | Photoresist |
Syringe | BD | 309628 | 1 mL Luer-Lok syringe |
UV crosslinker | Uvitec | CL-508 | UV crosslinker |