该协议提供了一个3D仿生模型与伴随的纤维频闪隔间。用生理上相关的水凝胶配制,比例模仿频闪细胞外基质的生物物理特性,是细胞相互作用、肿瘤生长和转移的活性介质。
肝细胞癌(HCC)是慢性肝病后发展为一种原发性肝肿瘤。慢性肝病和炎症导致纤维化环境积极支持和推动肝癌发生。因此,从肿瘤频闪微环境与肿瘤细胞之间的相互作用来看,对肝癌发生机制的洞察具有相当的重要性。三维(3D)细胞培养模型被提出为当前体外2D细胞培养模型和体内动物模型之间的缺失联系。我们的目标是设计一个新的3D生物仿生HCC模型与伴随纤维频闪室和血管。生理上相关的水凝胶,如胶原蛋白和纤维蛋白原被纳入模仿肿瘤ECM的生物物理特性。在此模型中,嵌入在水凝胶基质中的 LX2 和 HepG2 细胞被播种到倒置的跨膜插入物上。然后,HUVEC细胞被播种到膜的对面。制备了三种配方,由嵌入细胞的ECM-水凝胶组成,生物物理特性由流变学决定。细胞存活率是由细胞生存能力测定在21天内决定的。化疗药物多索鲁比辛的效果在2D共生和我们的3D模型中评估了72h。流变结果表明,纤维化、胆汁和HCC肝的生物物理特性可以成功模仿。总体而言,结果表明,与传统 2D 文化相比,这种 3D 模型更能代表体内环境。我们的3D肿瘤模型显示化疗反应下降,模仿HCC患者通常看到的耐药性。
肝细胞癌(HCC)占所有原发性肝癌的90%1,2。每年有81万人死亡,85.4万新发病例,目前排名世界第五,死亡率最高。HCC的发展主要归因于与慢性肝病有关的炎症,即病毒性肝炎、慢性过量饮酒、代谢综合征、肥胖症和糖尿病1、3、4。 与这些病理条件相关的炎症导致肝细胞损伤和各种细胞因子的分泌,激活和招募肝细胞和炎症细胞,以启动纤维化5。肝细胞在肝纤维化的启动、进展和回归中起着关键作用。激活后,它们分化成肌纤维细胞,如具有收缩、亲炎和亲纤维化特性的细胞6、7、8。由此产生的纤维化反过来又导致细胞外基质重塑酶活性的调节不力,造成一种环境,其特点是整体刚度增加,同时生长因子分泌,这进一步促成了HCC发病机理9,10。正是这种肝细胞和频闪环境之间的连续致病反馈回路,助长了癌症的发病,上皮到间质过渡(EMT),血管生成,转移潜力,和改变药物反应11,12,13。 因此,从机械学角度,而且从治疗角度,从肿瘤与肿瘤微环境的相互作用来看,对肝癌发生机制的洞察具有相当的重要性。
体外细胞培养模型的二维(2D)主要被80%的癌细胞生物学家使用。然而,这些模型并不代表真正的肿瘤微环境,它影响化疗反应14,15,16。目前96%的化疗药物在临床试验中失败14. 药物流失率的高发病率可归因于体外预检模型不能完全代表我们目前对HCC复杂性和微环境16的洞察和理解。相反,在体内动物模型存在免疫系统受损和肿瘤和微环境之间的相互作用差异相比,人类16,17。平均而言,只有8%的动物研究结果可以可靠地从临床前转换到临床环境16,17。因此,很明显,HCC的评价需要开发一个体外平台,有效地回顾肿瘤的复杂性,而且微环境。这些平台将补充目前可用的体外临床前筛查模型,并在未来7,14减少动物研究的数量。
其中一个平台是先进的三维(3D)细胞培养模型。在过去的十年里,许多研究HCC的先进3D模型已经出现,并且已经发表了各种评论。可用于研究 HCC 的 3D 模型包括多细胞球体、器官、脚手架模型、水凝胶、微流体和生物打印。其中,多细胞球体是肿瘤发育研究中最著名的模型之一。球状体是一个廉价的模型,技术难度低,同时有效地模仿体内肿瘤结构18,19,20。多细胞球体为HCC17、21、22的丰富信息做出了贡献。然而,由于多细胞球体在文化中保存在7至48天之间,因此缺乏标准化的文化时间。增加文化时间非常重要。艾伦贝格尔发现,球形年龄的差异深刻地影响索拉菲尼布(一种用于治疗肝癌的激酶抑制剂)的扩散性和毒性23。虽然弗热辛斯基和费伊发现,3D肝细胞球形需要18天,以重建关键的生理肝功能后,尝试,并继续显示稳定的功能,长达24天后,这种恢复24,25。
一些更先进的 3D HCC 模型包括使用人类去细胞化肝脚手架和生物打印脚手架。Mazza和他的同事利用不适合移植的去细胞化人类肝脏,为HCC建模创造了一个天然的3D脚手架。这些天然脚手架可以成功地重新填充21天,由肝类恒星和肝母细胞共同培养,同时保持关键的细胞外基质组件的表达,如胶原蛋白I型、III型、IV型和纤维素。除疾病建模外,该模型还具有功能器官移植和临床前药物和毒性筛查26的优点。随着 3D 生物打印的进步,3D 细胞外矩阵脚手架现在也可以进行生物打印。 马和他的同事,生物打印的细胞外矩阵脚手架具有可变的机械特性和生物仿生微构造使用水凝胶工程师从去细胞化细胞外矩阵27。毫无疑问,这些都是优秀的3D HCC模型。然而,人类肝脏的缺乏和获得必要设备和材料所涉及的费用使这些模型处于不利地位。此外,这些方法在技术上都是先进的,需要广泛的培训,可能不是很容易提供给所有研究人员。
基于 HCC 的复杂性和现有 3D 模型,我们努力开发一个包罗万象的 3D HCC 模型。我们的目标是通过结合可调水凝胶刚度值来回顾前期和肿瘤微环境的模型。 此外,我们还包括肝细胞和频闪相关细胞系,这些细胞系在HCC的发病机制中起着关键作用。其中包括内皮细胞、肝细胞和恶性肝细胞,它们生长在由生理相关水凝胶组成的微环境中。与选定的水凝胶,胶原蛋白I型和纤维蛋白原,纳入的比例可与生物物理变化在HCC的启动和进展期间看到肝脏僵硬。 此外,我们的目标是建立一种可以长期保存在文化中的模式。我们设想了一个模块化、经济高效的模型,可以配备基本设备、最少的培训和经验以及现成的材料。
此协议描述了为 HCC 创建仿生模型的方法的开发。已建立明确的工作流程,并确定了所涉及的关键步骤。这些关键步骤包括:准备纤维蛋白原体液,用胶原蛋白涂覆插入物,将注入水凝胶的细胞播种。在纤维蛋白原库存溶液的制备过程中,在较高浓度下以较小的增量添加纤维蛋白原非常重要。这不仅会减少纤维蛋白原溶解所需的时间,而且还会防止纤维蛋白原像 图11中看到的不一致和过早地凝胶。纤维蛋白原凝胶的制备需要相当长的时间,这可能会影响整个实验成功。结果表明,一旦纤维蛋白原凝胶开始凝胶不一致,最好丢弃它。插入物应涂上胶原蛋白,用PBS清洗,并在层压流罩内干燥,然后播种嵌入水凝胶中的细胞。如果不能确保插入物干燥,将导致水凝胶溢出到插入器的边缘,导致凝胶不均匀。凝胶的不均匀性最终将影响扩散是一个因素的结果。
图11:为纤维蛋白原/胶原蛋白水凝胶配方制备纤维蛋白原凝胶。 (A) 纤维蛋白原凝胶溶液,已形成团块,并开始过早凝胶与未溶解的纤维蛋白原粘附在管子上。(B) 纤维蛋白原凝胶溶液已完全溶解,溶液清晰,粘性稍高。 请点击这里查看此数字的较大版本。
建议在将水凝胶细胞悬浮物播种到插入物上时尽可能快地工作,因为纤维蛋白原成分将开始与血栓添加交叉。 在高浓度的凝胶悬架下工作时,准备更小的工作量,以防止凝胶在播种时相互关联。后者将对每口井的分布和凝胶播种量产生影响。添加组件的顺序至关重要,在此协议中,我们提供了简化的工作流程,以防止凝胶过早交叉链接。 由于水凝胶悬架的粘度,在混合和测量过程中建议使用切割移液器尖端工作。 混合悬架时,请确保快速均匀地完成此工作,以创建均匀的悬架。不均匀的混合将导致异构凝胶,这将对结果产生负面影响,见图12。
图12:胶原蛋白/纤维蛋白原凝胶种子到12个井板上。 所有凝胶的种子体积为 200μL,含有 2 毫克/mL 胶原蛋白和 20 毫克/mL 纤维蛋白原,具有 2.0 x 106 细胞/mL。(A) 具有异质稠度、可见不均匀分布的水凝胶的水凝胶。(B) 水凝胶均匀混合。 请点击这里查看此数字的较大版本。
在协议优化之后,对模型进行了评估,以确定模型的生物物理特性。流变学资料显示,我们的模型由生理上相关的细胞外基质组件组成,即胶原蛋白I型和纤维蛋白原,能够模仿纤维化、胆管和HCC肝28、29、30、31、32的生物物理特性。为 HCC 的 3D 模型回顾肝脏刚度非常重要,在模型开发过程中经常被忽视。肝僵硬增加与HCC38中的化疗耐药性、增殖性、迁移性和休眠性有关。虽然HCC中肝固态细胞的激活与细胞外基质刚度增加有关,但与这些肝固态细胞相关的几个信号通路显示机电敏度39。
在HCC的3D模型开发中,将肝细胞和内皮细胞等与频闪相关的细胞纳入其中,已变得越来越相关。研究表明,与PXT小鼠模型和人类HCC组织样本17相比,由肝细胞和HCC细胞组成的多细胞球体提高了化疗耐药性和侵入性迁移,同时模拟了体内的HCC肿瘤外观。Jung等人的类似研究,2017年发现由肝细胞癌(Huh-7)和内皮(HUVEC)细胞组成的多细胞球形促进血管化和侵略性22。与 Huh-7 单培养球形22相比,这些球形在多克索鲁比辛和索拉芬尼的浓度显著提高时显示出生存能力。与二维共生模型相比,我们模型的可行性和对多克索鲁比辛的反应(刚度值与 HCC 和加入频闪相关细胞 (LX2 和 HUVEC) 相符)的评价显示,与化疗相比,对化疗的反应也相应减少。 因此,有效模仿患者和其他 3D HCC 模型中常见的耐药性。
由于这是一个模块化系统,因此可以通过添加其他细胞外基质组件(即层压素和透明质酸)来强化该模型。或者,本模型中使用的当前水凝胶可以由合成水凝胶(如藻酸钠或奇托桑)取代。对当前模型的进一步修改可能是用原细胞培养物替换细胞系,以产生一个更与生理相关的模型,或者使用其他肿瘤和频闪细胞系的组合。
因此,我们成功开发了具有可调谐生物物理特性的3D模型,用于研究HCC中的肿瘤-频闪相互作用。 我们发现,与传统的 2D 文化相比,我们的模型更能代表体内情况,以应对多克索鲁比辛。然而,仍有许多工作要做,我们希望广泛描述这个模型,并探索模型作为一个可能的转移平台,以回答更复杂和紧迫的问题,留在研究HCC。
The authors have nothing to disclose.
这项研究的资金来自瑞典癌症基金会(癌症基金会,CAN2017/518)、瑞典医学研究协会(SSMF,S17-0092)、O.E.och Edla约翰松斯基金会和奥尔加·扬松斯基金会。 这些资金来源没有参与研究设计:数据的收集、分析和解释;编写报告;并在决定提交文章出版。本协议中使用的定制设计隔间的3D打印是在U-PRINT:乌普萨拉大学位于 U-PRINT@mcb.uu.se 医学和药学学科领域的3D打印设施进行的。我们要感谢保罗·奥卡拉汉对我们项目的宝贵投入。
AlamarBlue (Resazurin sodium salt) | Sigma | 211-500 | Prepare according to manufacturesr recommendations |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma | A5955-100ML | |
Aprotinin Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78432 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-2.5KG | Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% |
CO2 Incubator | Kebo Biomed Sweden | ||
Corning Black, clear flat bottom 96-well plate | Sigma | CLS3904-100EA | |
Corning HTS Transwell-24 well permeable supports | Sigma | CLS3396-2EA | HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs |
Discovery Hybrid Rheometer 2 | TA instruments, Sollentuna, Sweden | ||
DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells) | Thermo Fisher Scientific | 61965059 | Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution |
Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC) | Cell Applications, Inc | 211-500 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand | Thermo Fisher Scientific | A3160902 | |
Fibrinogen type I-S from bovine plasma | Sigma | F8630-10G | |
FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
Hanks' balanced salt solution | Sigma | H9394-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate |
Labogene scanspeed 416 centrifuge | Labogene, Sweden | ||
Laminar flow hood | Kebo Biomed Sweden | ||
Mettler Toledo AG245 Analytical Balance | Mettler Toledo | ||
Nikon TMS Light microscope | Nikon, Japan | ||
Phosphate buffered saline tablet | Sigma | P4417-100TAB | Prepare according to manufacturers recommendation |
Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL | Ibidi | 50201 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Merck | B619298 | |
TC20 Automated cell counter | BioRad | ||
TC20 cell counter counting slides | BioRad | ||
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5) |
Trypsin (2.5%) 10x | Thermo Fisher Scientific | Dilute to 1x in PBS | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T6414-100ML | Solution, sterile-filtered |