SEC-BioSAXS-Messungen biologischer Makromoleküle sind ein Standardansatz zur Bestimmung der Lösungsstruktur von Makromolekülen und deren Komplexen. Hier analysieren wir SEC-BioSAXS-Daten aus zwei Arten häufig auftretender SEC-Spuren – Chromatogramme mit vollständig aufgelösten und teilweise aufgelösten Peaks. Wir zeigen die Analyse und Dekonvolution mit Scatter und BioXTAS RAW.
BioSAXS ist eine beliebte Technik, die in der Molekular- und Strukturbiologie verwendet wird, um die Lösungsstruktur, Partikelgröße und -form, das Verhältnis zwischen Oberfläche und Volumen und konforme Veränderungen von Makromolekülen und makromolekularen Komplexen zu bestimmen. Ein qualitativ hochwertiger SAXS-Datensatz für die Strukturelle Modellierung muss aus monodispersen, homogenen Proben stammen, die oft nur durch eine Kombination aus Inlinechromatographie und sofortiger SAXS-Messung erreicht werden. Am häufigsten wird die Größenausschlusschromatographie verwendet, um Proben zu trennen und Verunreinigungen und Aggregationen vom Teilchen des Interesses auszuschließen, so dass SAXS-Messungen von einem gut aufgelösten chromatographischen Gipfel einer einzelnen Proteinart durchgeführt werden können. Dennoch ist in einigen Fällen selbst die Inline-Reinigung keine Garantie für monodisperse Proben, entweder weil mehrere Komponenten in ihrer Größe zu nah beieinander liegen oder Formänderungen durch Bindung saugen die wahrgenommene Elutionszeit verändern. In diesen Fällen kann es möglich sein, die SAXS-Daten eines Gemischs zu dekonvolutieren, um die idealisierten SAXS-Kurven einzelner Komponenten zu erhalten. Hier zeigen wir, wie dies erreicht wird und die praktische Analyse der SEC-SAXS-Daten an idealen und schwierigen Proben durchgeführt wird. Insbesondere zeigen wir die SEC-SAXS-Analyse der Vaccinia E9 DNA-Polymeraseexonuklease minus Mutant.
Biologische Makromoleküle sind zu klein, um selbst mit den besten Lichtmikroskopen gesehen zu werden. Aktuelle Methoden zur Bestimmung ihrer Strukturen beinhalten in der Regel die Kristallisation des Proteins oder Messungen an einer großen Anzahl identischer Moleküle gleichzeitig. Die Kristallographie liefert zwar Informationen über den atomaren Wert, stellt jedoch eine künstliche Probenumgebung dar, da die meisten Makromoleküle nicht in kristalliner Form in der Zelle dargestellt werden. In den letzten Jahren lieferte die Kryo-Elektronenmikroskopie ähnliche hochauflösende Strukturen großer Makromoleküle /makromolekularer Komplexe, aber obwohl die Proben näher am physiologischen Zustand sind, sind sie immer noch gefroren, daher unbeweglich und statisch. Die Bio-Kleinwinkel-Röntgenstreuung (BioSAXS) ermöglicht eine strukturelle Messung des Makromoleküls unter für die Biologie relevanten Bedingungen. Dieser Zustand kann als eine auf Einer Nanometerskala bestimmte 3D-Form mit niedriger Auflösung visualisiert werden und erfasst den gesamten Konformationsraum des Makromoleküls in Lösung. BioSAXS-Experimente bewerten oligomere Zustand, Domäne und komplexe Arrangements sowie Flexibilität zwischen den Domänen1,2,3effizient. Die Methode ist genau, meist zerstörungsfrei und erfordert in der Regel nur ein Minimum an Probenvorbereitung und Zeit. Für die beste Interpretation der Daten müssen die Stichproben jedoch monodisperse sein. Das ist eine Herausforderung; biologische Moleküle sind oft anfällig für Verunreinigungen, schlechte Reinigung und Aggregation, zum Beispiel durch Gefrierauftauen4. Die Entwicklung der Inlinechromatographie, gefolgt von sofortiger SAXS-Messung, trägt dazu bei, diese Effekte zu mildern. Die Größenausschlusschromatographie trennt die Proben nach Größe und schließt damit die meisten Verunreinigungen und Aggregationen5,6,7,8,9,10aus. In einigen Fällen reicht jedoch sogar SEC-SAXS nicht aus, um eine monodisperse Probe zu erzeugen, da das Gemisch aus Komponenten bestehen kann, die zu nah an der Größe sind oder ihre physikalischen Eigenschaften oder ihre schnelle Dynamik zu überlappenden Spitzen in der SEC-UV-Spur führen. In diesen Fällen kann ein softwarebasierter Dekonvolutionschritt der erhaltenen SAXS-Daten zu einer idealisierten SAXS-Kurve der einzelnen Komponente5,11,12führen. Als Beispiel zeigen wir in Protokollabschnitt 2 die Standard-SEC-SAXS-Analyse der Vaccinia E9 DNA-Polymeraseexonuklease minus Mutant (E9 exominus) in Komplex mit DNA. Vaccinia stellt den Modellorganismus der Poxviridae dar, einer Familie, die mehrere Krankheitserreger enthält, zum Beispiel das menschliche Pockenvirus. Es wurde gezeigt, dass die Polymerase in biochemischen Ansätzen eng an die DNA bindet, wobei die Struktur des Komplexes vor kurzem durch Röntgenkristallographie13gelöst wurde.
Die meisten Synchrotron-Anlagen bieten eine automatisierte Datenverarbeitungspipeline, die Datennormalisierung und Integration durchführt und eine Reihe von nicht subtracted Frames erzeugt. Der in diesem Manuskript beschriebene Ansatz könnte jedoch auch mit einer Laborquelle verwendet werden, sofern SEC-SAXS durchgeführt wird. Darüber hinaus kann eine zusätzliche Automatisierung zur Verfügung stehen, die strahlungsgeschädigte Rahmen zurückweist und die Puffersubtraktion14durchführt. Wir zeigen, wie Sie die primäre Datenanalyse für vorverarbeitete Daten durchführen und die verfügbaren Daten in Abschnitt 2 nutzen können.
In Abschnitt 3 zeigen wir, wie SEC-SAXS-Daten dekonvolute und die Kurven effizient analysiert werden. Zwar gibt es mehrere Dekonvolution-Methoden wie die Gaußsche Peak-Dekonvolution, implementiert in US-SOMO15 und die Guinier optimierte Maximum-Likelihood-Methode, implementiert in der DELA-Software16, diese erfordern in der Regel ein Modell für die Peak-Form12. Die endliche Größe einzelner Spitzen, die wir untersuchen, ermöglicht die Verwendung von Evolving Factor Analysis (EFA), als eine verbesserte Form der Singular Value Decomposition (SVD), um überlappende Spitzen zu dekonvolute, ohne sich auf die Spitzenform oder das Streuprofil5,11zu verlassen. Eine SAXS-spezifische Implementierung finden Sie in BioXTAS RAW17. EFA wurde zum ersten Mal für Chromatographiedaten verwendet, als 2D-Dioden-Array-Daten erlaubten, Matrizen aus Absorption gegen Aufbewahrungszeit und Wellenlängendaten zu bilden18. Wo EFA zeichnet sich aus, ist, dass es sich auf den sich entwickelnden Charakter von Singularwerten konzentriert, wie sie sich mit dem Aussehen neuer Komponenten verändern, mit dem Vorbehalt, dass es eine inhärente Ordnung in der Akquisition10gibt. Glücklicherweise liefern SEC-SAXS-Daten alle notwendigen geordneten Erfassungsdaten in organisierten 2D-Datenarrays und verleihen sich gut an die EFA-Technik.
In Abschnitt 4 zeigen wir die Grundlagen der modellunabhängigen SAXS-Analyse aus der subtrahierten SAXS-Kurve im Pufferhintergrund. Die modellunabhängige Analyse bestimmt den Kreisradius (Rg), das Korrelationsvolumen (Vc), das Porod-Volumen (Vp) und den Porod-Debye-Exponent (PE). Die Analyse liefert eine semiquantitative Bewertung des thermodynamischen Zustands des Teilchens in Bezug auf Kompaktheit oder Flexibilität über das dimensionlose Kratky-Diagramm2,4,19.
Schließlich werden SAXS-Daten in wechselseitigen Raumeinheiten gemessen, und wir zeigen, wie die SAXS-Daten in den realen Raum transformiert werden, um die Verteilungsfunktion “Paarentfernung” (P(r) wiederherzustellen. Die P(r)-Verteilung ist der Satz aller Entfernungen innerhalb des Partikels und enthält die maximale Dimension des Partikels, dmax. Da es sich um eine thermodynamische Messung handelt, stellt die P(r)-Verteilung den physischen Raum dar, der vom Konformationsraum der Teilchen belegt wird. Die richtige Analyse eines SAXS-Datasets kann Lösungszustandseinblicke bieten, die hochauflösende Informationen aus Kristallographie und Kryo-EM ergänzen.
Es ist wünschenswert, eine monodisperse Probe zu haben, bevor sie ein SAXS-Experiment startet, aber in Wirklichkeit erfüllen viele Datensammlungen dies nicht und müssen durch die Kombination der Messung mit der Inlinechromatographie – sec in den meisten Fällen – verbessert werden. Doch selbst der Zeitmangel zwischen Reinigung und Datenerfassungsmonodispersität der Probe ist nicht garantiert. Dies gilt am häufigsten für Experimente, bei denen Komponenten zu nah an der Größe oder in ihren physikalischen Eigenschaften sind, um getrennt zu werden, oder die anfällig für schnelle Dynamik sind. Hier haben wir ein Protokoll bereitgestellt, das die Zersetzung einzelner Werte mit der sich entwickelnden Faktoranalyse kombiniert, um den Einfluss von DNAbound E9 exominus aus seiner ungebundenen Form zu entfernen und ein monodisperses Streuprofil zu erstellen, das wir dann mit dem SAXS-Paket Scatter IV analysieren konnten.
SVD mit EFA von SEC-SAXS-Daten sind sehr leistungsfähige Methoden, die entwickelt wurden, um SAXS-Daten zu dekonvoluten und die Analyse zu verbessern, aber sie haben Einschränkungen. Sie verlangen, dass Rauschen oder Driften in der Pufferbasislinie des SEC-SAXS auf ein Minimum beschränkt werden. Dies kann eine zusätzliche Spaltenäquilibration (besser, um mehr als 3 Spaltenvolumes, abhängig vom Puffer) vor dem Laden der Stichprobe zu verwenden. Der wichtigste Schritt ist jedoch die Wahl der Anzahl der Singularwerte und des verwendeten Datenbereichs, da dies die Genauigkeit der Dekonvolution stark beeinflussen wird. Aus diesem Grund sollten die Ergebnisse nicht auf eigene Faust, sondern mit Techniken wie analytischer Ultrazentrifugation (AUC) oder Multi-Winkel-Laser-Lichtstreuung (MALLS) zur biologischen Interpretation weiter analysiert werden.
Scatter IV ist ein neues Softwarepaket, kostenlos für Forschung und industrielle Nutzung mit einer intuitiven Benutzeroberfläche, die es auch Nicht-Experten ermöglicht, ihre Daten zu analysieren. Scatter IV verfügt über mehrere neue Funktionen, die zur Verbesserung der Analyse von SEC-SAXS-Daten beitragen, wie z. B. die mit dem Signaldiagramm verknüpfte Heatmap, die eine höhere Genauigkeit bei auswahlnachlassender Rahmenauswahl ermöglicht. Bei der primären Datenanalyse bieten die Guinier Peak-Analyse und das mit der P(r)-Analyse verbundene Cross-Validierungsdiagramm eine integrierte Fehlerbehebungsfähigkeit in der Software.
Es sollte erwähnt werden, dass viele andere Programme für die primäre Datenanalyse verwendet werden können; Diese enthalten die gleichen grundlegenden Funktionen und werden auch regelmäßig aktualisiert, wie BioXTAS RAW17 ATSAS-Paket24 und US-SOMO15, um nur einige zu nennen.
Unabhängig davon, welches SAXS-Paket für die Analyse verwendet wird, sind die wichtigsten Einschränkungen üblich: die Probenvorbereitung vor der Entnahme und Analyse. Im gezeigten Beispiel E9 exominus ist die Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses und mit einer Reduktion des Rg der dmax, die mit einer monodispersen Probe verbunden ist, deutlich zu erkennen. Dies wird die weitere Verarbeitung der Daten wie Fitting oder Modellierung mit bekannten hochauflösenden Strukturen erheblich unterstützen.
The authors have nothing to disclose.
Wir würdigen die finanzielle Unterstützung des Projekts durch das französische Stipendium REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 und durch Forschungsstipendien des Service de Santé des Armées und der Délégation Générale pour l’Armement. Wir danken dem ESRF für die SAXS-Strahlzeit. Diese Arbeit nutzte die Plattformen des Grenoble Instruct-ERIC Zentrums (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) im Rahmen der Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), unterstützt von FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) und GRAL, finanziert von der University Grenoble Alpes graduate school (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). Die IBS erkennt die Integration in das Interdisziplinäre Forschungsinstitut von Grenoble (IRIG, CEA) an. Wir danken Wim P. Burmeister und Frédéric Iseni für die finanzielle und wissenschaftliche Unterstützung und wir danken auch Dr. Jesse Hopkins von BioCAT an der APS für seine Hilfe und für die Entwicklung von BioXTAS RAW.
Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
BioXTAS Raw 1.2.3. | MacCHESS | http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html | First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins |
HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
Scatter | Diamond Light Source Ltd | http://www.bioisis.net/tutorial/9 | Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany) |
Superdex 200 Increase 5/150 GL column | GE Healthcare | 28990945 | SEC-SAXS column used |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B |