Визуализация дрозофилы меланогастера с использованием микрокомпьютерной томографии
Özet
Представлен протокол, позволяющий визуализировать интактную Drosophila melanogaster на любой стадии развития с помощью микрокомпьютерной томографии.
Abstract
Инструменты биомедицинской визуализации позволяют исследуть молекулярные механизмы в пространственных масштабах, от генов до организмов. Drosophila melanogaster, хорошо охарактеризованный модельный организм, извлек выгоду из использования световой и электронной микроскопии для понимания функции генов на уровне клеток и тканей. Применение платформ визуализации, которые позволяют понять функцию генов на уровне всего интактного организма, еще больше расширит наши знания о генетических механизмах. Здесь представлен целый метод визуализации животных, который описывает шаги, необходимые для визуализации дрозофилы на любой стадии развития с использованием микрокомпьютной томографии (μ-КТ). Преимущества μ-CT включают коммерчески доступные приборы и минимальное практическое время для получения точной 3D-информации с разрешением на микронном уровне без необходимости вскрытия тканей или методов очистки. В сочетании с программным обеспечением, которое ускоряет анализ изображений и 3D-рендеринг, может быть выполнен подробный морфометрический анализ любой ткани или системы органов, чтобы лучше понять механизмы развития, физиологию и анатомию как для описательных, так и для проверки гипотез. Используя рабочий процесс визуализации, который включает в себя использование электронной микроскопии, световой микроскопии и μ-КТ, можно провести тщательную оценку функции гена, тем самым способствуя полезности этого мощного модельного организма.
Introduction
Методы визуализации, которые позволяют детально иссировать внутренние структуры объекта, не разрушая его общую 3D-архитектуру, оказались широко полезными для ряда различных дисциплин, включая физику, инженерию, материаловедение, археологию, палеонтологию, геологию и биологию1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Среди этих методов неразрушающей визуализации рентгеновские платформы особенно полезны из-за способности высокоэнергетических рентгеновских лучей проникать во многие различные типы образцов и материалов с минимальным рассеянием по сравнению с волнами видимого света. Таким образом, компьютерная томография (КТ), микрокомпьютная томография (μ-КТ), нанокомпьютная томография (нано-КТ) и синхротронная микротомография стали основными технологиями для рентгеновской визуализации образцов от метров до микрон с миллиметровым и субмикронным разрешением10,11,12,13,14.
Хотя эти платформы различаются по своей конструкции, геометрии рентгеновского излучения и компонентам, чтобы сбалансировать размер и разрешение выборки, все они полагаются на один и тот же основной принцип захвата изображения: источник рентгеновских лучей, которые проходят через объект и захватываются детектором. Дифференциальное затухание рентгеновского пучка при его прохождении через различные плотности внутри объекта создает контраст изображения. 3D-данные получаются путем вращения либо образца, либо детектора, собирая серию 2D-проекционных изображений, которые затем реконструируются с помощью алгоритмов в томограммы, содержащие 3D-информацию, разрешение которой изотропно в x,y,z15. Для многих настольных μ-КТ-сканеров, которые используют конусно-лучевую рентгеновскую геометрию для проецирования рентгеновских лучей на визуализируемый объект, алгоритм Фельдкампа используется для точной реконструкции объекта с минимальными ошибками16.
Разрешающая способность данной платформы определяется, прежде всего, системными параметрами, такими как размер рентгеновского пучка (размер пятна), геометрия сканера (расстояние от объекта до источника рентгеновского излучения), размер пикселей на детекторе и используемый алгоритм реконструкции. Дополнительные факторы, такие как вибрации сканера, флуктуации рентгеновского пучка, движение образца и тип материала или химическое пятно, используемое для визуализации объекта, также могут значительно влиять на пространственное разрешение при реальных условиях визуализации15.
Для биомедицинских применений КТ и μ-КТ сыграли ключевую роль в продвижении нашего понимания анатомии, физиологии, развития и механизмов заболевания, служа инструментом как для диагностики пациентов, так и в качестве доклинической платформы визуализации для модельных организмов17,18. Например, Mouse International Phenotyping Consortium, целью которого является идентификация функции каждого гена в геноме мыши, использует μ-CT как часть своего конвейера фенотипирования19. Их результаты имеют решающее значение для понимания генов, участвующих в процессах развития и заболевания, а также служат атласом для анатомии и развития мышей20. Другие модельные организмы, такие как рыбки данио и крысы, также полностью приняли использование μ-CT для выполнения фенотипирования целых животных ряда генных мутантов17,21,22,23.
Преимущество объединения визуализации целых животных с модельными организмами заключается в том, что механистическое понимание функции генов для данного биологического процесса может быть полностью изучено. Это возможно благодаря хорошо охарактеризованным геномам и многим генетическим инструментам, доступным в модельных организмах, которые позволяют точно манипулировать функцией генов в различных временных точках развития, специфических тканях, отдельных клетках и даже субклеточных органеллах. К ним относятся двоичные системы выражения, такие как система UAS/GAL4 (и ее многочисленные производные), CRISPR/Cas9 и RNAi24,25,26. Когда эти генетические инструменты используются в сочетании с мощным конвейером визуализации, состоящим из электронной микроскопии, световой микроскопии (флуоресцентной и нефлуоресцентной) и визуализации всего животного, такой как μ-CT, может быть достигнута тщательная оценка молекул, клеток, тканей, органов и всего организма, что позволяет гораздо глубже понять функцию генов.
Этот протокол фокусируется на использовании μ-CT в модельном организме Drosophila melanogaster, не являющихся млекопитающими, чьи бесчисленные генетические инструменты помогли прояснить многочисленные молекулярные механизмы26,27. Он был принят из предыдущих протоколов в немоделических насекомых1,28,29,30,31,32и основывается на предыдущих исследованиях μ-CT у дрозофилы, чтобы установить стандартизированный протокол для его использования у этого животного33,34,35,36,37,38,39. ,40,41. Описаны этапы успешной подготовки образцов, визуализации и анализа наборов данных fly μ-CT с использованием коммерчески доступных сканеров. С помощью этого протокола все стадии развития мухи могут быть визуализированы с высоким разрешением как для описательных, так и для проверки гипотез исследований, включая таксономию, анатомию, развитие, физиологию и заболевание27. Этот протокол также будет полезен для визуализации практически любых насекомых и даже неживых материалов, которые требуют химического окрашивания для контрастности изображения для улучшения визуализации с помощью μ-CT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Визуализация неповрежденной Drosophila melanogaster на всех этапах развития оставалась проблемой, в первую очередь из-за несовместимости световой микроскопии с толстой пигментированной кутикулой, обнаруженной у этого животного. В то время как другие методы визуализации целых животных, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ), оптическая когерентная томография (ОКТ) и ультрамикроскопия в сочетании с очисткой тканей, были успешно использованы умух50,51, 52,53, 54,μ-КТ представляет ряд преимуществ, которые делают его идеальным для визуализации всего животного этого организма13,15,30 . Рентгеновские лучи легко проникают в пигментированную кутикулу, а их малая длина волны позволяет проводить субмикронные изображения. Маркировка требует минимальных инвестиций в широко доступные химические вещества и отсутствия специализированных навыков стенда13. μ-КТ сканеры также коммерчески доступны, а затраты сопоставимы с платформами световой микроскопии, а также более привлекательны для более широкого круга дисциплин (геология, палеонтология, инженерия и т. Д.), Которые также могут извлечь выгоду из его доступности в учреждении. Синхротронные рентгеновские источники также могут использоваться для μ-КТ-визуализации высокого разрешения фиксированных и живых насекомых31,55,56,но менее доступны, чем коммерческие настольные сканеры.
Этот протокол обеспечивает эффективный способ получения μ-КТ изображений взрослых мух, куколок, личинок и клеточных эмбрионов. Обратите внимание, что для многих шагов, описанных выше, альтернативные методы также могут быть применены для подготовки образцов к визуализации. Другие исследования предоставили подробное сравнение различных этапов фиксации, маркировки и сушки для использования у насекомых, и тем, кто заинтересован в принятии этогометода,рекомендуется оценить достоинства каждого подхода1,4,13,29,30,57. Хотя этот протокол относительно прост, представлено несколько полезных предложений.
Во-первых, следует соблюдать осторожность при разрушении кутикулы неповрежденных образцов, чтобы подлежащие мягкие ткани существенно не нарушались. Важно дать личиночной и ранней стадиям куколки зафиксироваться в течение 2 часов в растворе Буэна перед тыканием. Это усилит ткань и ограничит количество гемолимфы, которая будет сочиться из отверстий кутикулы, что может изменить архитектуру органа. Отдельные сегменты тела (голова, грудная клетка и брюшко) взрослого человека могут быть разделены, если там расположены интересующих структуры. Рекомендуется использовать скальпель, чтобы чисто разрезать эти сегменты, а не раздвигать их щипцами, что может нарушить 3D-архитектуру кишечника или центральной нервной системы, например. Что касается времени, взрослым обычно требуется всего 16 часов. для полной фиксации, тогда как личинкам и куколкам необходимо 24 ч. Кроме того, если окрашивание йодом или ПТА кажется неравномерным, образец можно поместить обратно в раствор для инкубации дольше до тех пор, пока не будет достигнуто равномерное окрашивание. Наконец, гидратированные образцы не следует помещать при 4 °C, так как это, по-видимому, вызывает образование пузырьков воздуха в полости тела после нагревания до комнатной температуры.
Во-вторых, монтаж образца будет варьироваться в зависимости от инструмента, типа ступени и того, должен ли образец оставаться гидратированным или был высушен в критической точке. При гидратации убедитесь, что образец не протекает и, возможно, не разрушает сканер. При установке образца внутрь наконечника пипетки обязательно осторожно надавите на притупленный предмет, пока образцы не столкнутся с небольшим сопротивлением и не смогут двигаться. Слишком сильное нажатие может привести к деформации кутикулы и основным структурным дефектам. Также убедитесь, что образец выровнен в держателе как можно ближе к оси вращения. Любое колебание увеличит время сканирования из-за большего поля зрения и уменьшит разрешение конечной томограммы после реконструкции.
В-третьих, настройки сканера для получения проекционных изображений также будут варьироваться в зависимости от прибора. Чтобы максимизировать разрешающая способность сканера, размер пятна рентгеновского пучка должен быть как можно меньше (5-10 мкм). Это может быть достигнуто путем балансировки рентгеновских настроек напряжения и тока таким образом, чтобы общая мощность составила 3-4 Вт. С этими настройками и соответствующим временем экспозиции на камере может быть достигнуто надлежащее ослабление рентгеновского пучка образцом и оптимальная контрастность изображения. Использование алюминиевых или медных фильтров между объектом и источником рентгеновского излучения может быть использовано для тонкой настройки оптимальных настроек энергии рентгеновского излучения для наилучшего контраста изображения или ослабления луча достаточно для использования источников с более высокой мощностью. Что касается разрешения изображения, это будет зависеть от множества различных переменных, включая тип пятна, количество проекционных изображений, размер пикселя изображения, положение камеры, движение образца, вибрации сканера и параметры реконструкции. Фантом стержневого рисунка (QRM GmbH), содержащий маркеры известных размеров, может помочь оценить пространственное разрешение для данного сканера и настройки камеры.
Также стоит оценить достоинства визуализации критических точек высушенных или гидратированных образцов. Sombke et al. провели сравнительную оценку двух методов и обнаружили, что сушка в критической точке превосходит применение μ-КТ с участием членистоногих30. Однако преимущества гидратированных образцов заключаются в том, что животные подвергаются меньшему химическому и механическому воздействию, которое может привести как к количественным, так и к морфологическим артефактам. Это также имеет тенденцию сохранять нежные ткани лучше, чем CPD. Однако гидратированные образцы имеют гораздо более короткий срок годности и должны быть получены не позднее, чем через месяц после фиксации, поскольку деградация тканей и снижение качества изображения становятся очевидными в этот момент. Кроме того, разрешение гидратированных образцов будет немного меньше, чем у высушенного образца в критической точке, потому что рентгеновские лучи также должны проникать как через пластиковый наконечник пипетки, так и через окружающую жидкость (воду или буфер). Высушенные образцы могут храниться в течение гораздо более длительных периодов времени, особенно при хранения на дриерите. Они также могут быть размещены непосредственно на пути рентгеновского луча, просто приклеив крылья или ножки к штифту насекомого и поместив его в сценический патрон, упрощая процесс монтажа. Однако обширное обезвоживание этанола в этих образцах может привести к усадке тканей и потере деликатной тканевой архитектуры, поэтому важно выполнить ряд увеличивающихся концентраций EtOH, чтобы свести к минимуму эти эффекты. Тем не менее, следует отметить, что все формы химической обработки, включая фиксацию параформальдегида и даже окрашивание йодом, могут вызвать усадку тканей58,59. Хотя ни один из методов не обеспечит измерения «фактического размера органа» у живой мухи, морфометрические измерения по-прежнему действительны при сравнении животных мутантного и дикого типа, если этапы фиксации, окрашивания и сушки выполняются одинаково для обоих наборов образцов — предпочтительно параллельно.
В заключение, μ-CT предоставляет полезный инструмент визуализации всего животного для дрозофилы33,34,35,36,37,38,39,40,41. Многие другие исследования продемонстрировали силу этой технологии для понимания различных аспектов таксономии насекомых, экологии, физиологии, развития и анатомии, которые могут помочь в будущих исследованиях на мухах1,28,30,31,32,55,56,57 . В сочетании с инструментами генетической и световой микроскопии, уже широко используемыми в этом организме, μ-CT может позиционировать себя в экспериментальном конвейере, который позволяет глубже понять генотип и фенотип.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Все это было бы невозможно без поддержки Насера Русана. Я хотел бы поблагодарить Х. Дуга Морриса, Даниэль Донахью и Бренду Клаунберг из NIH Mouse Imaging Facility и Бена Аче из Micro Photonics за обучение и полезную дискуссию. Я также благодарю Мансуру Норузи Рада из Цейсса за сканирование образцов живота на Xradia 520 Versa. Лорен Смит, Саманта Смит и Рэйчел Нг также помогали со сканированием. Майк Марш из Object Research Systems обеспечил техническую поддержку Dragonfly. Я также благодарен за поддержку со стороны Национального института сердца, легких и крови (1K22HL137902-01) и стартовых фондов Университета Вайоминга. Я также благодарю анонимных рецензентов за их полезные предложения и комментарии.
Materials
| 100% Ethanol | For critical point drying | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | For animal fixation |
| Critical Point Dryer | Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300) | ||
| Dragonfly Software | Object Research Systems | For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html | |
| Heat Block | For microfuge tubes | ||
| Image Analysis Workstation | Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering | ||
| Iodine Solution (I2KI) | Fisher Scientific | SI86-1 | For staining |
| Microcomputed Tomography Scanner | Bruker | Skyscan 1172 | Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size. |
| Microcomputed Tomography Scanner Software | Bruker | For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.) | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | For poking hole in cuticle |
| NRecon Image Reconstruction Software | Bruker | Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry | |
| P10 pipet tips | Genesee Scientific | 24-120 | Sample mounting |
| Phosphate Buffered Saline | Resarch Products International | P32060-4000.0 | Dilute to 1X with water before use |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25g | For staining |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | For Minutien Pins |
| Triton X-100 | Research Products International | 111036 | To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST) |
| X-Ray Microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa | Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™) |
Referanslar
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
- Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
- Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
- Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
- Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686 (2014).
- Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144 (2014).
- Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
- Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
- Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
- Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
- Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
- Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21 (2020).
- Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
- Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , 2 (2019).
- Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612 (1984).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
- Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531 (2018).
- Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898 (2019).
- Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
- Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetik. 201 (3), 815-842 (2015).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768 (2016).
- Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380 (2016).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, 51-71 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures – the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
- Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
- Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
- Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
- Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
- Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
- Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
- Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, 374-377 (2008).
- Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
- Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087 (2019).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
- Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
- Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817 (2008).
- Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557 (2009).
- Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213 (2016).
- Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1 (2010).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6 (2007).
- Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
