微小断層撮影による ショウジョウバエメラノガスター の動物全体イメージング

1. サンプルの選択とキューティクルの準備 イメージングに適した発達のタイムポイント(胚、幼虫、子犬、または成人)を選択します。 胚性の段階では、酵母ペーストで塗られたブドウジュース寒天プレートのケージメスは、30〜60分ごとに卵を収集します。適切な段階に達するまで、これらの胚を25°Cで発達させる。 幼虫段階では、時を取った胚採取実験から第1および第2の星を採取する。非混雑状態の下で食品バイアルの側面から3番目 の星を直接選びます。 子犬のタイミングについては、白いプレパエ(逆尖乳)を収集し、キューティクルが茶色になり始める時間をメモします。動物はキューティクル褐変後の定義された時点で15段階のプパル開発を進め、それに応じて42を収集することができる。 エクロイオンに続く処女として大人を収集し、必要な時間(例えば、完全な腸の発達のために5日間)の食品バイアルで老化することができます。 5~50匹の動物を、1xリン酸緩衝塩水(0.5%PBST)で0.5%トリトンX-100の1mLを含む1.5mLマイクロ遠心分離チューブに移します。ベンチトップでチューブを定期的にタップしながら、室温(RT)で5分間インキュベートして疎水性コーティングの除去を支援し、動物が完全に水没できるようにします。 胚、幼虫、およびプパル段階の場合、チューブを100°Cに設定したヒートブロックに20sセットし、RTで5分間冷却して、さらに発達を阻止する。注:動物はまた、液体窒素37でフラッシュ冷凍することができます。 2. 固定と染色 0.5% PBST を取り出し、ブインの溶液を 1 mL 追加します。チューブをタップして、動物が完全に水没していることを確認します。注意:ブインの溶液はホルムアルデヒドが含まれています。こぼれると皮膚や目に急性毒性を引き起こし、飲み込むと致命的になる可能性があります。取り扱い時には手袋、安全眼鏡、ラボコートを着用してください。注: エタノールの使用など、追加の固定技術を使用することもできます。他の固定剤のメリットについては、ref.1,30で詳しく説明します。 胚および成体サンプルの場合、RTで16〜20時間ベンチトップにインキュベートする。 幼虫とパパルのサンプルの場合は、RTで2時間動物を固定し、ブインの溶液を捨て、1x PBSで5分間洗浄します。1x PBSを含むマルチウェル解剖皿に移し、ホルダーに取り付けられた小さなミヌティエンピンを使用して、下の軟部組織を破壊しないように注意して前部と後部キューティクルに穴を開けます。 幼虫とパパルのサンプルをマイクロフュージチューブに戻し、新鮮なブインの溶液を1 mL加えます。RTで24時間ベンチトップにインキュベート。 ブインの溶液を取り除き、μ-CTウォッシュバッファー(0.1 M Na2HPO 4、1.8%スクロース)または1x PBS 3thriceの1 mLで30分間サンプルを洗浄します。 適切な染色液を1 mL加え、ベンチトップに2~7日間インキュベートします。注:ステインの選択は多くの要因に依存しますが、一般的には浸透、インキュベーション時間、解像度のバランスです。一般に、ホスホタングジン酸(PTA)は、軟組織の優れたコントラストと分解能を提供しますが、キューティクルの機械的破壊と長いインキュベーション時間が必要です。異なる染色タイプのメリットについては、ref.1で詳しく説明します。 ヨウ素染色には、0.1 N I2KI(ルゴール溶液)の1mLを使用してください。2日間インキュベートします。大人のキューティクルのこれ以上の破壊は必要ありません。 ホスホタンスチン酸(PTA)染色の場合は、水で希釈した0.5%(w/v)溶液の1mLを使用してください。ホルダーに取り付けられた小さなミヌティエンピンで口の部分を取り除くか、胸郭または腹部キューティクルの穴を突くことによって、大人のキューティクルを破壊します。5〜7日間インキュベート、または組織染色が不均一に見える場合は長い。 1 mLの超純水または1x PBSで30分間洗浄します。洗浄工程を繰り返します。RTで動物を超純水または1x PBSで最大1ヶ月間保管してください。 動物が水分補給中にスキャンされる場合は、セクション4に直接進みます。サンプルの保存時間を長くする必要がある場合は、プロトコルのセクション 3 に進みます。 3. 臨界点乾燥(オプション) エタノール(EtOH)脱水シリーズをサンプル上で行う:10%、25%、50%、75%、100%、100%。EtOH溶液を1 mL添加し、記載された順番で各濃度に対して1時間ベンチトップにインキュベートします。 最後の100%EtOHが浸漬した後、新鮮な100%EtOHに交換し、サンプルを一晩ベンチトップにインキュベートさせます。 メーカーの指示に従ってサンプルの臨界点乾燥を行います。注:電子顕微鏡機能には、一般に、EtOH脱水後のサンプルの乾燥を行う重要な点乾燥機( 材料表を参照)があります。 4. サンプル取り付け 重篤な点で乾燥したサンプルの場合、ホットグルーサンプルは、回転段階のチャック内に収まるように設計された昆虫ピンまたは他のホルダーに、プラスチックまたはガラスキャピラリーチューブ(〜1.0〜1.25mm内径)に入れるように設計されています。 水和サンプルの場合、P10ピペットチップに水を充填し、漏れを防ぐためにヒートシールまたはパラフィンフィルムのいずれかで狭い端を固定します。注意: 水がスキャナーに漏れて損傷を引き起こさないように、接続をしっかりとラップしてください。 鉗子を使用して、1つの標本をピペットチップに移します。鈍い20G針や別のピペットチップなどの長くて細い物体を使用して、パイプチップの壁に接触して所定の位置に保持するまで、サンプルを慎重にチップに押し下げます。 ピペットチップの開口部をパラフィンフィルムで覆い、長時間のスキャン中に水が蒸発するのを防ぎます。 回転ステージのチャック内に収まるように設計されたホルダーを使用してP10ピペットを取り付けます(図1A-C)。 5. スキャン その日のイメージング前に機械の必要なキャリブレーションを実行します。注: これらは製造元によって異なりますので、適切な手順を決定するためにアプリケーションの専門家に相談することをお勧めします。このプロトコルで使用されるセットアップおよびソフトウェアに関する具体的な情報については、 資料表 を参照してください。一般に、回転ステージに対して軸外にチャックに関連する「ぐらつき」を取り除き、カメラ上で均一な背景ピクセル強度を確保するためにフラットフィールド補正を実行するステージ軸の位置合わせなどのキャリブレーションは、複数のスキャンで同等の解像度とデータセットに最適なイメージング条件を提供します。 ソフトウェアの左上隅にある [ドアを開く] アイコンをクリックして、回転するステージのチャックにアクセスするためにスキャナーのドアを開きます。サンプルホルダーのベースの周りに襟を締めてサンプルを取り付けます。メモ:スキャナーの位置合わせを維持するために、サンプルを回転チャックに取り付ける際に穏やかな圧力を使用してください。 最適な解像度とコントラストを得るためのスキャナーの制御をソフトウェアでスキャンパラメータに設定します。注:これらは、X線源、カメラ/検出器、および各スキャナの形状がメーカーによって異なるため、経験的に決定する必要があります。最適なパラメータを選択するための追加情報は、製造元のアプリケーションスペシャリストだけでなく、ここでも43を見つけることができます。 X-Ray 電源制御を開きます (オプション|X線源。スライダーバーを使用してX線電圧を30-40 kVに、電流を100-110 μAに設定して、3-4Wのパワーを備えたX線ビームと、解像度を高める小さなスポットサイズを生成します。 [取得モード]ダイアログボックス(オプション|を使用する取得モード) をクリックして、カメラの露出時間を 500 ~800 ミリ秒に設定します。 ソフトウェア下部にある虫眼鏡アイコンの横にあるスライダーバーを使用して、カメラの設定と位置に応じて、目的の画像ピクセルサイズ(〜700 nm〜4 μm)を設定します。これにより、スキャン中に取得される投影画像の数が決定され、より多くのプロジェクションが解像度を高めるが、スキャン時間が長くなります( 代表的な結果を参照)。 ソフトウェアの下部にある回転矢印の横にあるスライダーバーをクリックしてドラッグし、サンプルを 360° 回転パスに沿って移動します。サンプルが視野の中に残っていることを確認します。 ソフトウェアの上部にある [取得開始] アイコン (青丸の矢印アイコン) をクリックします。追加のスキャン パラメータを設定できるダイアログ ボックスが表示され、スキャンを保存して名前を付けるファイルと出力フォルダが表示されます。 ランダムな動きを10と平均4-6フレームに設定します。回転ステップは、使用するカメラの設定に応じて自動的に計算されます。 [取得] ダイアログ ボックスで[OK] をクリックしてスキャンを開始します。スキャン時間を示す 2 番目の進行状況バー ダイアログが表示されます。スキャナーは、回転経路に沿って標本の一連の投影画像(図1D)を取得し、監視する必要はありません。 6. 復興 図を生成するには、投影画像を用いて画像再構成を行う。メモ:コーンビーム幾何スキャナからの画像のほとんどすべての再構成はFeldkampアルゴリズム16に依存していますが、個々のパラメータはソフトウェアの実装によって異なり、経験的に決定する必要があります。以下の設定は、市販のソフトウェアに固有の( 資料表を参照)をガイドとして使用することができる。不整列補正、リングアーチファクトリダクション、ビーム硬化補正(ほとんどのフライサンプルでは0%)などのパラメータを反復的に実行し、最終的な再構築に最適な値を選択します。再構築プロセスをより詳細に制御したい上級ユーザーは、MATLAB インターフェイスを参照してください44. 参照スキャンに基づくシフト補正アルゴリズムを利用して初期画像配置を行う45 (アクション |X/Y の位置合わせと参照スキャン)。 各再構成パラメータを微調整する (開始|微調整)。 これにより、[パラメータ微調整]ダイアログ ボックスがアクティブになります。 [次へ] を [ 配置後 ] をクリックして、配置を微調整します。反復回数を 5 に設定し、パラメータ ステップを 1.0 に設定します。[スタート]ボタンをクリックして、一連のプレビューを生成します。正しく配置されているイメージを選択します。注:適切に整列した画像はぼやけたり、そうでなければ連続した構造(キューティクルなど)が分割されている場合に「せん断」アーチファクトを表示しません。 リングアーティファクトの減少を微調整するには、その隣をクリックします。反復回数を 5 に設定し、パラメータ ステップを 1.0 に設定します。[ スタート ]ボタンをクリックして、一連のプレビューを生成します。リングの数が最も少ないイメージを選択します。 上記のパラメータが最適な画像を提供するように最適化されたら、選択した値が[設定]タブ([設定])で正しく表示されていることを確認します。 ヒストグラムを用いて任意の最終的な明るさとコントラスト値を調整し、ビット深度およびタイプなどのファイルパラメータを、対象とする領域(ROI)を利用して、対象の構造のみを包含する(例えば、全体のフライまたはヘッドのみ)計算時間を短縮する(出力)。 再構築を開始する(|を開始する開始)。 複数の再構成が必要な場合は、現在のイメージをバッチ マネージャーに追加します (開始|バッチに追加)、 残りの画像に対して手順 6.2 ~ 6.5 を繰り返します。 7. 画像解析 2次元と3次元のトモグラムを視覚化し、フリーウェアまたは商用ソフトウェアでさらなるモルフォメトリクス分析を行います。注: このプロトコルで使用されるソフトウェアの詳細については、 資料一覧を参照してください。μ-CT データセットを評価できる他のソフトウェア パッケージには、フィジー46、Seg3D (www.seg3D.org)47、ITK-SNAP48、商用ソフトウェア (AMIRA など) などのフリーウェア オプションが含まれます。セグメンテーション プロセスを半自動化するために機械学習ベースのアルゴリズムを使用する他のアプリケーションは、ワークフローを高速化し、人間のバイアスを減らすのに役立ちます (例: Biomedisa49)。 ソフトウェアにトモグラムファイルをインポートします (ファイル|イメージ ファイルのインポートファイルに関連付けられたメタデータは、自動的にウィンドウに読み込まれますが、イメージのプロパティに合わせて手動で設定することもできます。 目的の構造を分割するには、画面の左側にある [セグメント] タブをクリックします。新しい対象地域の作成 (ROI) (基本|新しい)に名前を付け、適切な色を選択します。 対象の構造を包含するしきい値範囲を定義する (範囲| スライダー バーを使用して範囲を定義します。 適切な 2D または 3D ROI ペインタツールモード(ROI ペインタ|ペイントブラシオプション)。 しきい値で定義された領域をペイントします。Ctrl キーを 押しながらマウスの左キーを押します。領域を削除するには 、Shift キー を押しながらマウスの左キーを押したままにします。メモ:円形または正方形のペイントブラシのサイズを変更するには、Ctrl キーまたは Shift キーを押しながらマウスホイールをスクロールするだけです。 Zボリューム全体を通して、目的の構造を描き続けます。 ROI をメッシュに変換する (エクスポート|メッシュ|へ通常)。 右上隅にある [データ プロパティ と 設定] パネルでメッシュ オーバーレイをクリックして、メッシュ オーバーレイをハイライト表示します。 適切な数の反復を使用してメッシュをスムーズにする(スムーズ メッシュ|イテレーション)。注: 比較するすべてのイメージに同じメッシュ スムージング反復値を使用します。 基本的なモルフォメトリクス解析のために、画面右側の情報パネルにメッシュ ROI(表面積、体積、フェレット径)の測定値が表示されていることを確認します。追加の分析は、オブジェクト分析モジュールを使用して実行できます。 メッシュ オブジェクトと、すべてのトモグラム イメージをレンダリングし、3D で視覚化します。組み込みのムービー メーカーを使用してオブジェクトのビデオを生成する (マウスの右ボタンをクリック|ビューアの 個別のフレームを使用してムービーメーカーを表示する([キーを追加])。注: いくつかの視覚機能は、特定の機能などを強調するために、右側のパネルの視覚効果タブを使用してムービーに適用することができます。 ムービー メーカーの [アニメーションのエクスポート ] ボタンを使用して、ビデオをエクスポートして表示します。