Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie
Özet
Es wird ein Protokoll vorgestellt, das die Visualisierung intakter Drosophila melanogaster in jedem Entwicklungsstadium mittels Mikrocomputed Tomographie ermöglicht.
Abstract
Biomedizinische Bildgebungswerkzeuge ermöglichen die Untersuchung molekularer Mechanismen über räumliche Skalen hinweg, von Genen bis hin zu Organismen. Drosophila melanogaster, ein gut charakterisierter Modellorganismus, hat von der Verwendung von Licht- und Elektronenmikroskopie profitiert, um die Genfunktion auf der Ebene von Zellen und Geweben zu verstehen. Die Anwendung von Bildgebungsplattformen, die ein Verständnis der Genfunktion auf der Ebene des gesamten intakten Organismus ermöglichen, würde unser Wissen über genetische Mechanismen weiter verbessern. Hier wird eine ganze Tierbildgebungsmethode vorgestellt, die die Schritte beschreibt, die erforderlich sind, um Drosophila in jedem Entwicklungsstadium mittels Mikrocomputed Tomographie (μ-CT) zu visualisieren. Zu den Vorteilen μ-CT gehören kommerziell erhältliche Instrumente und minimale praktische Zeit, um genaue 3D-Informationen mit Einer Auflösung auf Mikrometerebene zu erzeugen, ohne dass Gewebedissektions- oder Clearingmethoden erforderlich sind. In Kombination mit Software, die die Bildanalyse und das 3D-Rendering beschleunigt, kann eine detaillierte morphometrische Analyse jedes Gewebe- oder Organsystems durchgeführt werden, um entwicklungs-, physiologie- und anatomiemechanismen sowohl für beschreibende als auch für Hypothesenteststudien besser zu verstehen. Durch die Verwendung eines bildgebungstechnischen Workflows, der den Einsatz von Elektronenmikroskopie, Lichtmikroskopie und μ-CT umfasst, kann eine gründliche Bewertung der Genfunktion durchgeführt werden, wodurch die Nützlichkeit dieses leistungsstarken Modellorganismus weiter unterstützt wird.
Introduction
Bildgebende Verfahren, die eine detaillierte Untersuchung der inneren Strukturen eines Objekts ermöglichen, ohne seine gesamte 3D-Architektur zu zerstören, haben sich für eine Reihe verschiedener Disziplinen als sehr vorteilhaft erwiesen, darunter Physik, Ingenieurwesen, Materialwissenschaften, Archäologie, Paläontologie, Geologie und Biologie1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Unter diesen zerstörungsfreien Bildgebungsmethoden sind röntgenbasierte Plattformen besonders nützlich, da hochenergetische Röntgenstrahlen im Vergleich zu sichtbaren Lichtwellen viele verschiedene Probentypen und Materialien mit minimaler Streuung durchdringen können. Computertomographie (CT), Mikrocomputed Tomography (μ-CT), Nanocomputed Tomography (Nano-CT) und Synchrotron-Mikrotomographie haben sich daher als die primären Technologien für die röntgenbasierte Bildgebung von Proben von Metern bis Mikrometern mit Auflösungsfähigkeiten von Millimetern bis Submikromin10,11,12,13,14herausgestellt.
Während sich diese Plattformen in ihrem Design, ihrer Röntgengeometrie und ihren Komponenten unterscheiden, um Probengröße und Auflösung auszugleichen, basieren sie alle auf dem gleichen Grundprinzip für die Bilderfassung: eine Quelle von Röntgenstrahlen, die durch das Objekt wandern und von einem Detektor erfasst werden. Die differentielle Dämpfung des Röntgenstrahls beim Durchlaufen unterschiedlicher Dichten innerhalb des Objekts erzeugt einen Bildkontrast. 3D-Daten werden erhalten, indem entweder die Probe oder der Detektor gedreht wird, wobei eine Reihe von 2D-Projektionsbildern gesammelt wird, die dann mithilfe von Algorithmen zu Tomogrammen rekonstruiert werden, die 3D-Informationen enthalten, deren Auflösung in x, y, z15isotrop ist. Für viele Benchtop-μ-CT-Scanner, die eine Kegelstrahl-Röntgengeometrie verwenden, um Röntgenstrahlen auf das abgebildete Objekt zu projizieren, wird der Feldkamp-Algorithmus verwendet, um das Objekt mit minimalen Fehlern genau zu rekonstruieren16.
Die Auflösung einer gegebenen Plattform wird in erster Linie durch Systemparameter wie die Größe des Röntgenstrahls (Spotgröße), die Scannergeometrie (Entfernung vom Objekt zur Röntgenquelle), die Größe der Pixel auf dem Detektor und den verwendeten Rekonstruktionsalgorithmus bestimmt. Zusätzliche Faktoren wie Scannerschwingungen, Röntgenstrahlschwankungen, Probenbewegung und Materialtyp oder chemischer Fleck, der zur Visualisierung des Objekts verwendet wird, können die räumliche Auflösung unter realen Bildgebungsbedingungen ebenfalls erheblich beeinflussen15.
Für biomedizinische Anwendungen haben CT und μ-CT eine Schlüsselrolle bei der Verbesserung unseres Verständnisses von Anatomie, Physiologie, Entwicklung und Krankheitsmechanismen gespielt und dienen sowohl als Werkzeug für die Diagnose menschlicher Patienten als auch als präklinische Bildgebungsplattform für Modellorganismen17,18. Zum Beispiel nutzt das Mouse International Phenotyping Consortium, dessen Ziel es ist, die Funktion jedes Gens im Mausgenom zu identifizieren, μ-CT als Teil ihrer Phänotypisierungspipeline19. Ihre Ergebnisse waren entscheidend für das Verständnis von Genen, die an Entwicklungs- und Krankheitsprozessen beteiligt sind, und dienten gleichzeitig als Atlas für die Anatomie und Entwicklung vonMäusen 20. Andere Modellorganismen, wie Zebrafische und Ratten, haben die Verwendung von μ-CT zur Durchführung der Phänotypisierung ganzer Tiere einer Reihe von Genmutanten17,21,22,23 ebenfallsvollständig angenommen.
Der Vorteil der Kombination von Ganztierbildgebung mit Modellorganismen besteht darin, dass ein mechanistisches Verständnis der Genfunktion für einen bestimmten biologischen Prozess vollständig erforscht werden kann. Dies ist möglich aufgrund der gut charakterisierten Genome und vieler genetischer Werkzeuge, die in Modellorganismen verfügbar sind, die eine präzise Manipulation der Genfunktion zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten, spezifischen Geweben, einzelnen Zellen und sogar subzellulären Organellen ermöglichen. Dazu gehören binäre Expressionssysteme wie das UAS/GAL4-System (und seine vielen Derivate), CRISPR/Cas9 und RNAi24,25,26. Wenn diese genetischen Werkzeuge in Verbindung mit einer leistungsfähigen Bildgebungspipeline verwendet werden, die aus Elektronenmikroskopie, Lichtmikroskopie (fluoreszierend und nicht fluoreszierend) und ganzer Tierbildgebung wie μ-CT besteht, kann eine gründliche Bewertung von Molekülen, Zellen, Geweben, Organen und dem gesamten Organismus erreicht werden, was ein viel tieferes Verständnis der Genfunktion ermöglicht.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von μ-CT im Nicht-Säugetier-Modellorganismus Drosophila melanogaster, dessen unzählige genetische Werkzeuge dazu beigetragen haben, zahlreiche molekulare Mechanismen aufklärtzuhaben 26,27. Es wurde von früheren Protokollen bei Nicht-Modellinsekten1,28,29,30,31,32übernommen und baut auf früheren μ-CT-Studien in Drosophila auf, um ein standardisiertes Protokoll für seine Verwendung bei diesem Tier zu erstellen33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Die Schritte zur erfolgreichen Probenvorbereitung, Bildgebung und Analyse von Fliegen-μ-CT-Datensätzen mit handelsüblichen Scannern werden skizziert. Mit diesem Protokoll können alle Entwicklungsstadien der Fliege in hoher Auflösung sowohl für deskriptive als auch für hypothesentestende Studien visualisiert werden, einschließlich Taxonomie, Anatomie, Entwicklung, Physiologie und Krankheit27. Dieses Protokoll wird auch für die Abbildung praktisch aller Insekten und sogar nicht lebender Materialien nützlich sein, die eine chemische Färbung für den Bildkontrast erfordern, um die Visualisierung durch μ-CT zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Visualisierung intakter Drosophila melanogaster in allen Entwicklungsstadien ist eine Herausforderung geblieben, vor allem aufgrund der Inkompatibilität der Lichtmikroskopie mit der dicken, pigmentierten Nagelhaut dieses Tieres. Während andere Bildgebungsverfahren für ganze Tiere, wie Magnetresonanztomographie (MRT), Optische Kohärenztomographie (OCT) und Ultraschall in Verbindung mit Gewebereinigung, erfolgreich bei Fliegen50,51,52,53,54, μ-CT eine Reihe von Vorteilen bietet, die es ideal für die Bildgebung von ganzen Tieren dieses Organismus machen13,15,30 . Röntgenstrahlen dringen leicht in die pigmentierte Nagelhaut ein und ihre kleine Wellenlänge ermöglicht eine Submikranz-Bildgebung. Die Etikettierung erfordert minimale Investitionen in weit verbreitete Chemikalien und keine speziellen Bankkenntnisse13. μ-CT-Scanner sind ebenfalls im Handel erhältlich, und die Kosten sind vergleichbar mit Lichtmikroskopie-Plattformen, sind aber auch für ein breiteres Spektrum von Disziplinen (Geologie, Paläontologie, Ingenieurwesen usw.) attraktiver, die auch von ihrer Verfügbarkeit an einer Institution profitieren können. Synchrotron-Röntgenquellen können auch für hochauflösende μ-CT-Bildgebung von festen und lebenden Insekten31,55,56verwendet werden, sind jedoch weniger zugänglich als kommerzielle Tischscanner.
Dieses Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, μ-CT-Bilder von Erwachsenen, Puppen, Larven und zellularisierten Embryonen zu erhalten. Beachten Sie, dass für viele der oben beschriebenen Schritte auch alternative Methoden angewendet werden können, um Proben für die Bildgebung vorzubereiten. Andere Studien haben einen detaillierten Vergleich der verschiedenen Fixierungs-, Markierungs- und Trocknungsschritte für die Verwendung bei Insekten geliefert, und diejenigen, die an der Anwendung dieser Technik interessiert sind, werden ermutigt, die Vorzüge jedes Ansatzes1,4,13,29,30,57zu bewerten . Während dieses Protokoll relativ einfach ist, werden einige hilfreiche Vorschläge vorgestellt.
Erstens sollte bei der Störung der Nagelhaut intakter Proben darauf geachtet werden, dass darunter liegende Weichteile nicht signifikant gestört werden. Es ist wichtig, Larven- und frühe Puppenstadien für 2 Stunden in Bouins Lösung fixieren zu lassen, bevor Sie stochern. Dies versteift das Gewebe und begrenzt die Menge an Hämolymphe, die aus den Nagelhautlöchern austritt, was die Organarchitektur verändern kann. Einzelne Körpersegmente (Kopf, Thorax und Bauch) des Erwachsenen können getrennt werden, wenn sich die interessierenden Strukturen dort befinden. Es wird empfohlen, diese Segmente mit einem Skalpell sauber zu durchschneiden, anstatt sie mit einer Zinnen auseinanderzuziehen, was beispielsweise die 3D-Architektur des Darms oder des zentralen Nervensystems stören könnte. Was das Timing betrifft, benötigen Erwachsene in der Regel nur 16 Stunden. für eine vollständige Fixierung, während Larven- und Puppenstadien 24 Stunden benötigen. Wenn die Jod- oder PTA-Färbung ungleichmäßig erscheint, kann die Probe wieder in Lösung gelegt werden, um länger zu inkubieren, bis eine gleichmäßige Färbung erreicht ist. Schließlich sollten hydratisierte Proben nicht bei 4 °C platziert werden, da dies nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur die Bildung von Luftblasen in der Körperhöhle zu induzieren scheint.
Zweitens variiert die Probenmontage je nach Instrument, Bühnentyp und ob die Probe hydratisiert bleiben muss oder an kritischen Stellen getrocknet wurde. Wenn Sie hydratisiert sind, stellen Sie sicher, dass die Probe nicht ausläuft und möglicherweise den Scanner zerstört. Wenn Sie die Probe in einer Pipettenspitze montieren, achten Sie darauf, vorsichtig mit einem abgestumpften Gegenstand zu drücken, bis die Proben auf leichten Widerstand stoßen und sich nicht bewegen können. Zu hartes Drücken kann zu Nagelhautverformungen und zugrunde liegenden strukturellen Defekten führen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Probe im Halter so nah wie möglich an der Drehachse ausgerichtet ist. Jedes Wackeln erhöht die Scanzeiten aufgrund des größeren Sichtfelds und reduziert die Auflösung des endgültigen Tomogramms nach der Rekonstruktion.
Drittens variieren die Scannereinstellungen für die Aufnahme von Projektionsbildern ebenfalls je nach Instrument. Um die Auflösungsfähigkeit des Scanners zu maximieren, sollte die Größe des Röntgenstrahlflecks so klein wie möglich sein (5-10 μm). Dies kann erreicht werden, indem Röntgenspannungs- und Stromeinstellungen so ausgeglichen werden, dass die Gesamtleistung 3-4 W beträgt. Mit diesen Einstellungen und der entsprechenden Belichtungszeit an der Kamera kann eine korrekte Röntgenstrahldämpfung durch die Probe und ein optimaler Bildkontrast erreicht werden. Die Verwendung von Aluminium- oder Kupferfiltern zwischen dem Objekt und der Röntgenquelle kann verwendet werden, um die optimalen Röntgenenergieeinstellungen für den besten Bildkontrast zu verfeinern oder den Strahl ausreichend zu dämpfen, damit Quellen mit höherer Leistung verwendet werden können. Was die Bildauflösung betrifft, hängt dies von vielen verschiedenen Variablen ab, einschließlich Fleckentyp, Anzahl der Projektionsbilder, Bildpixelgröße, Kameraposition, Probenbewegung, Scannervibrationen und Rekonstruktionsparametern. Ein Balkenmusterphantom (QRM GmbH) mit bekannten Größenmarkierungen kann helfen, die räumliche Auflösung für eine bestimmte Scanner- und Kameraeinstellung zu bewerten.
Es lohnt sich auch, die Vorzüge der Bildgebung von getrockneten oder hydratisierten Proben mit kritischem Punkt zu bewerten. Sombke et al. führten eine vergleichende Bewertung der beiden Methoden durch und fanden die Trocknung kritischer Punkte für μ-CT-Anwendungen mit Arthropoden überlegen30. Die Vorteile von hydratisierten Proben bestehen jedoch darin, dass Tiere weniger chemischen und mechanischen Expositionen ausgesetzt sind, die sowohl zu quantitativen als auch zu morphologischen Artefakten führen können. Dies neigt auch dazu, empfindliches Gewebe besser zu erhalten als CPD. Hydratisierte Proben haben jedoch eine viel kürzere Haltbarkeit und sollten spätestens einen Monat nach der Fixierung abgebildet werden, da an dieser Stelle Gewebeabbau und verminderte Bildqualität offensichtlich werden. Außerdem ist die Auflösung von hydratisierten Proben etwas geringer als eine getrocknete Probe an kritischem Punkt, da Röntgenstrahlen auch durch eine Kunststoffpipettenspitze und die umgebende Flüssigkeit (Wasser oder Puffer) eindringen müssen. Critical Point Getrocknete Proben können für viel längere Zeit konserviert werden, insbesondere wenn sie auf Drierite aufbewahrt werden. Sie können auch direkt in den Röntgenstrahlweg gelegt werden, indem die Flügel oder Beine einfach an einen Insektenstift geklebt und in das Bühnenfutter gelegt werden, was den Montagevorgang vereinfacht. Die umfangreiche Ethanoldehydratisierung dieser Proben kann jedoch zu Gewebeschrumpfung und Verlust empfindlicher Gewebearchitektur führen, weshalb es wichtig ist, eine Reihe von steigenden EtOH-Konzentrationen durchzuführen, um diese Effekte zu minimieren. Dennoch ist zu beachten, dass alle Formen der chemischen Behandlung, einschließlich Paraformaldehydfixierung und sogar Jodfärbung, Gewebeschrumpfung verursachen können58,59. Während keine der beiden Methoden Messungen der “tatsächlichen Organgröße” in einer lebenden Fliege liefert, sind morphometrische Messungen beim Vergleich von Mutierten- und Wildtyptieren immer noch gültig, solange die Fixierungs-, Färbe- und Trocknungsschritte für beide Probensätze identisch durchgeführt werden – vorzugsweise parallel.
Zusammenfassend bietet μ-CT ein nützliches Bildbildwerkzeug für Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Viele andere Studien haben die Leistungsfähigkeit dieser Technologie für das Verständnis verschiedener Aspekte der Insektentaxonomie, Ökologie, Physiologie, Entwicklung und Anatomie gezeigt, die dazu beitragen können, zukünftige Studien in Fliegen1,28,30,31,32,55,56,57 zu informieren . In Kombination mit den genetischen und lichtmikroskopisch in diesem Organismus bereits weit verbreiteten Werkzeugen kann sich μ-CT innerhalb einer experimentellen Pipeline positionieren, die ein tieferes Verständnis zwischen Genotyp und Phänotyp ermöglicht.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts davon wäre ohne die Unterstützung von Nasser Rusan möglich gewesen. Ich möchte H. Doug Morris, Danielle Donahue und Brenda Klaunberg von der NIH Mouse Imaging Facility und Ben Ache von Micro Photonics für das Training und die hilfreiche Diskussion danken. Ich danke auch Mansoureh Norouzi Rad von Zeiss für das Scannen von Bauchproben auf der Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith und Rachel Ng halfen auch beim Scannen. Mike Marsh von Object Research Systems leistete technischen Support bei Dragonfly. Ich bin auch dankbar für die Unterstützung des National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) und der Start Up Funds der University of Wyoming. Ich danke auch den anonymen Rezensenten für ihre hilfreichen Vorschläge und Kommentare.
Materials
| 100% Ethanol | For critical point drying | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | For animal fixation |
| Critical Point Dryer | Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300) | ||
| Dragonfly Software | Object Research Systems | For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html | |
| Heat Block | For microfuge tubes | ||
| Image Analysis Workstation | Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering | ||
| Iodine Solution (I2KI) | Fisher Scientific | SI86-1 | For staining |
| Microcomputed Tomography Scanner | Bruker | Skyscan 1172 | Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size. |
| Microcomputed Tomography Scanner Software | Bruker | For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.) | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | For poking hole in cuticle |
| NRecon Image Reconstruction Software | Bruker | Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry | |
| P10 pipet tips | Genesee Scientific | 24-120 | Sample mounting |
| Phosphate Buffered Saline | Resarch Products International | P32060-4000.0 | Dilute to 1X with water before use |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25g | For staining |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | For Minutien Pins |
| Triton X-100 | Research Products International | 111036 | To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST) |
| X-Ray Microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa | Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™) |
Referanslar
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
- Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
- Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
- Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
- Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686 (2014).
- Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144 (2014).
- Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
- Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
- Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
- Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
- Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
- Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21 (2020).
- Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
- Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , 2 (2019).
- Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612 (1984).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
- Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531 (2018).
- Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898 (2019).
- Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
- Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetik. 201 (3), 815-842 (2015).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768 (2016).
- Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380 (2016).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, 51-71 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures – the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
- Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
- Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
- Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
- Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
- Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
- Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
- Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, 374-377 (2008).
- Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
- Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087 (2019).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
- Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
- Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817 (2008).
- Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557 (2009).
- Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213 (2016).
- Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1 (2010).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6 (2007).
- Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
