Quantifying Spontaneous Ca<sup>2+</sup> Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Eric  A. Bancroft; Rahul Srinivasan

doi:10.3791/61481

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Nörobilim

כימות ספונטני Ca²⁺ שטף ואת ההשפעות במורד הזרם שלהם בעכבר ראשי נוירונים המוח האמצעי

Published: September 09, 2020

doi:

10.3791/61481

Eric A. Bancroft¹, Rahul Srinivasan^1,2

¹Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics,Texas A&M University Health Science Center, College of Medicine, ²Texas A&M Institute for Neuroscience

Özet

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במבחנה Ca²⁺ שטף בנוירונים המוח האמצעי ואת ההשפעות שלהם במורד הזרם על caspase-3 באמצעות תרביות המוח האמצעי של העכבר הראשי. מודל זה יכול להיות מועסק כדי ללמוד שינויים פתופיזיולוגיים הקשורים פעילות Ca^{2+ חריגה} בנוירונים המוח האמצעי, ולסנן טיפולים רומן עבור תכונות אנטי אפופטוטיות.

Abstract

מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה ניוונית הרסנית הנגרמת על ידי ניוון של נוירונים דופאמין (DA). זרם מוגזם Ca²⁺ בשל ההפעלה החריגה של קולטני גלוטמט תוצאות ב-DA excitotoxicity וזוהה כמנגנון חשוב לאובדן נוירון DA. במחקר זה, אנו לבודד, לנתק, ותרבות באמצע המוח נוירונים מן mesencephalon הגחוני העכבר (VM) של עוברי עכבר ED14. לאחר מכן אנו מדביקים את תרביות המוח האמצעי של העכבר הראשי לטווח ארוך עם וירוס אדנו הקשורים (AAV) המבטא מחוון סידן מקודד גנטית, GCaMP6f תחת שליטה של מקדם סינפסין ספציפי לנוירון האנושי, hSyn. באמצעות הדמיה נוחה חיה, אנו מראים כי נוירונים באמצע המוח של העכבר תרבות להציג^{ספונטני Ca 2+} שטף שזוהה על ידי AAV-hSyn-GCaMP6f. יישום אמבטיה של גלוטמט לתרביות המוח האמצעי גורם לעלייה חריגה Ca^{2 תאיים בתוך} נוירונים וזה מלווה בהפעלה caspase-3 בנוירונים DA, כפי שהוכח על ידי immunostaining. הטכניקות לזיהוי אפופטוזיס גלוטמט בתיווך בעכבר הראשי DA נוירונים יש יישומים חשובים עבור הקרנת תוכן גבוה של תרופות השמירה על בריאות הנוירון DA.

Introduction

מחלת פרקינסון (PD) היא ההפרעה ניווניות השני הנפוץ ביותר בעולם, ללא תרופה ידועה. ההערכות מצביעות על כך ששכיחות המשטרה תמשיך לגדול והיא צפויה לעלות על מיליון אבחנות עד שנת 2030 בארצות הברית בלבד¹. עם מעט טיפולים יעילים הזמינים כיום למאבק ב-PD, יש צורך דחוף לפתח טיפולים יעילים יותר. PD מאופיין על ידי אובדן מהיר ומתקדם של דופמין באמצע המוח (DA) נוירונים². המנגנונים שבסיס ניוון עצבי בPD מובנים היטב. הראיות מצביעות על התכנסות סבירה של מנגנונים מרובים, כגון סטרס חמצוני ותפקוד מיטוכונדריאלי, וכו ‘שתורמים לחניכה של מפלים איתות אפופטוטי ובסופו של^{דבר מוות תא 3}.

מנגנון אחד כזה התכנסות, excitotoxicity בתיווך גלוטמט כבר מעורב במחלות ניווניות מרובות, כולל PD⁴. בעוד excitotoxicity בתיווך גלוטמט נחשב לעבוד בעיקר באמצעות גירוי של קולטני NMDA באמצעות עלייה מוגזמת בריכוז Ca^{2+ תאיים ובסופו} של דבר חניכה של אפופטוזיס, Ca²⁺-קולטני AMPA חדיר גם היו מעורבים בתגובה excitotoxic⁵^,⁶^,⁷. לכן, זה עניין כדי לקבוע את התרומה של קולטני AMPA אפופטוזיס גלוטמט בתיווך בתוך מודל PD. זה יכול להיות מושגת באמצעות NBQX, אמפא וחוסם kainate, אשר בריכוזי micromolar הוא סלקטיבי עבור קולטני AMPA⁸. תסיסה מתווכת גלוטמט ומפלים איתות אפופטוטי הם יעד אידיאלי במורד הזרם כדי למדוד את היקף המוות של תאים, ותורמטרה פוטנציאלית להתערבות טיפולית. לכן, פיתוח שיטה בעלת תוכן גבוה להערכת אפנון בתיווך גלוטמט של פעילות סידן ואיתות במורד הזרם הראשוני mesencephalic (VM) נוירונים יהיה בעל ערך להקרנת שיטות טיפול חדשניות על יכולתם לשמור על בריאות עצבית.

כאן, פיתחנו פרוטוקול שבו אנו מבטאים את מחוון סידן מקודד גנטית (GECI), GCaMP6f, באמצעות AAV2/5 עם מקדם סינפסין אנושי (hSyn) כדי למדוד את פעילות Ca^{2+ של} עכבר VM נוירונים ראשוניים בתגובה ליישום גלוטמט אשר ניתן למדוד ברמה הפיזיולוגית והמולקולרית. הקרנה זו תוכן גבוה יכול להיות מותאם לגילוי תרופות או טיפולים לווסת Ca^{2+ פעילות} כדי לשמור על הבריאות של נוירונים VM. אנו מציעים כי מודל תרבות ראשוני זה היא דרך יעילה לסנן התערבויות PD רומן, בהתבסס על יכולתם לשמור על הבריאות של נוירונים VM ולצמצם את ההתקדמות של PD.

Protocol

כל ההליכים הקשורים לשימוש בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש המוסדיים של אוניברסיטת טקסס A&M (25בנובמבר 2019; AUP# 2019-0346). הערה: הכנת פתרונות תרבות התא צריכה להיעשות באמצעות הליך סטרילי בקבינט בטיחות ביולוגית מסונן ב 0.2 μm כדי למנוע זיהום. 1. הכנת פתרונות ובינוני תרבות להכין תמיסת ציפוי למינין על ידי דילול 20 μL של 1 מ”ג / מ”ל למנין לתוך 2 מ”ל של H2O מזוקק סטרילי. להכין 10% סוס (סוס) סרום (ES) להפסיק פתרון על ידי הוספת 5 מ”ל של ES ל 45 מ”ל של 1x תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS). מסנן סטרילי באמצעות מערכת סינון 0.2 μm או קצה מסנן מזרק. לאחסן ב-4°C. הכן 4% סרום וסרום אלבומין (BSA) פתרון מניות על ידי הוספת 2 גרם של אבקת BSA 1x פוספט אגירה תמיסת מלח (PBS) ולהביא כרך סופי של 45 מ”ל. מסנן סטרילי באמצעות מערכת סינון 0.2 μm או קצה מסנן מזרק. לאחסן ב-4°C. להכין פתרון מלאי פאפין על ידי דילול פאפין ל 3 מ”ג / מ”ל ב 1x HBSS. מסנן סטרילי באמצעות מערכת סינון 0.2 μm או קצה מסנן מזרק. לאחסן ב -20 °C. להכין deoxyribonuclease (DNase) פתרון על ידי הוספת 20 מ”ג של אבקת DNase כדי סטרילי H2O ולהביא לנפח הסופי של 20 מ”ל. מסנן סטרילי באמצעות מערכת סינון 0.2 μm או קצה מסנן מזרק. לאחסן ב -20 °C. להכין פתרון מלאי חומצה אסקורבית על ידי הוספת 352 מ”ג של חומצה אסקורבית כדי סטרילי מזוקק H2O ולהביא לנפח הסופי של 20 מ”ל. מחממים ב-37 מעלות צלזיוס כדי להתמוסס במידת הצורך. מסנן סטרילי באמצעות מערכת סינון 0.2 μm או קצה מסנן מזרק. לאחסן ב -20 °C. להכין את תא תרבות בינונית על ידי הוספת הבאים 50 מ”ל של Neurobasal בינוני: 500 μL של גלוטמקס (100x), 500 μL סרום סוסים, 1 מ”ל של B-27, 100 μL של חומצה אסקורבית, 500 μL של פניצילין-סטרפטומיצין, 50 μL של kanamycin ו 50 μL של אאמפיצילין. מסנן סטרילי באמצעות מערכת סינון 0.2 μm. לאחסן ב-4°C. הכן 0.01% טריטון X-100 פתרון על ידי הוספת 1 מ”ל של Triton X-100 לתוך 9 מ”ל של PBS 1x כדי להפוך את פתרון 10%. כמו Triton X-100 הוא צמיגי, פיפטה לאט כדי לאפשר טיפ למלא לחלוטין. מחממים ב-37 מעלות צלזיוס כדי להתמוסס במידת הצורך. לאחסן ב-4°C. כדי לדלל 10% מניית טריטון X-100 ל-0.01%, לבצע 3 דילול טורי של 1:10. דילל 1 מ”ל של 10% מניות לתוך 9 מ”ל של 1x PBS כדי להפוך 1% פתרון. תדלל 1 מ”ל של 1% פתרון לתוך 9 מ”ל של PBS 1x כדי להפוך 0.1% פתרון. דילל 1 מ”ל של פתרון 0.1% לתוך 9 מ”ל של PBS 1x כדי להפוך פתרון 0.01%. הכן 10% ו-1% פתרון סרום עזים רגיל (NGS) על-ידי הוספת מ”ל אחד של NGS ל-9 מ”ל של PBS אחד לפתרון של 10%. הוסף 100 μL של NGS ל 9.9 מ”ל של PBS 1x כדי להפוך 1% פתרון. להכין פתרון מניות גלוטמט (100 mM) על ידי הוספת 735 מ”ג של L(+)-גלוטמית חומצה ל-H2O מזוקק סטרילי ולהביא לנפח סופי של 50 מ”ל. מסיסות בריכוז הזה תהיה בעיה. הוספת כרכים קטנים (100 μL) של 1 M חומצה הידרוכלורית מספיק כדי להגדיל את המסיסות. הכן פתרון מניות NBQX (10 מ”מ) על ידי הוספת 50 מ”ג של NBQX ל-H 2 Oמזוקקסטרילי ולהביא לנפח סופי של 13 מ”ל. 2. הכנת מנות תרבות וספלי כיסוי (נעשה יום לפני הניתוס) הערה: מצאנו כי שילוב של שלושה סוכני ציפוי, פולי-L-לינזין, פולי-L-ornithine, למינין מאפשר הידבקות תאי אידיאלית וכדאיות. מניחים 10 35 מ”מ צמיות פטרי בארונות בטיחות ביולוגיים. מניחים שני כיסויים עגולים של 12 מ”מ בכל מנה וממלאים ב-70% EtOH למשך 10 דקות. השתמש בקו ואקום כדי לשאוב את ETOH הנותרים מכל מנה, ומאפשר ETOH להתאדות לחלוטין. פיפט ~ 90-100 μL של 0.1% פתרון פולי-L-לינזין על כל כיסוי, לוודא כי כיסוי כולו מכוסה על ידי פתרון poly-L-לינזין. מכסים את הכלים במכסים וממקמים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. שאפף את תמיסת הפולי-ל-לינזין הנותרת מכל כיסוי ושטיפה עם H2O סטרילי. חזור על שלבים 2.2 – 2.3 עם פתרון פולי-L-ornithine 0.1%. שוב, חזור על שלבים 2.2 – 2.3 עם תמיסת למינין 0.01%. מניחים ב-37°C/5% CO2 אינקובטור עד להכנה לציפוי תא ביום שלמחרת. 3. תבניות עובריות עכבר הערה: אנו משתמשים בין 4 ל- 6 עכברים בהריון מתוזמן לכל תרבות. בעוד חלק גדול מתהליך הפירוק מתרחש מחוץ לארון בטיחות ביולוגי, עדיין חשוב לשמור על הליך סטרילי. שימוש בשפע של 70% EtOH על משטחים ליד מיקרוסקופ הניתור ועל כלים כירורגיים הוא אידיאלי. ניתן גם לחבוש מסכה במהלך הבדיקה כדי למנוע זיהום נוסף. בנוסף, אנו משתמשים 4 אנטיביוטיקה נפרדת במדיום התרבות, כך זיהום אינו סביר. עם זאת, אם השימוש באנטיביוטיקה הוא בעייתי, התקנה זו ניתן להעביר בתוך מכסה המנוע סטרילי. כדי לשמר את כדאיות התא כל פתרונות הבדיקה צריך להיות מקורר מראש ב 4 °C, ויש להשלים את ההתפרקויות מהר ככל האפשר. אנחנו לא מבצעים את התותכים בקרח. השיטה עבור פירוק של נוירונים המוח האמצעי עוברי העכבר זהה שיטות שתוארוקודם לכן 9,10. הכינו מקום על ספסל ליד מיקרוסקופ של פירוק עם משטח סופג וריסוס בליברליות עם 70% EtOH. ספריי שתי צגי פטרי מזכוכית 100 x 15 מ”מ וצלחת פטרי אחת מזכוכית 50 x 10 מ”מ עם 70% EtOH ואפשרו ל-EtOH להתאדות. לאחר התאדה, מניחים 50 מ”ל של HBSS סטרילי 1x לתוך כל 100 x 15 מ”מ צלחת פטרי. לשקוע מספריים כירורגיים, מרטפים, להב microtome ב 70% EtOH עבור 10 דקות מינימום כדי לחטא. מניחים את המכשירים על משטח סופג לייבוש. באמצעות CO2 ואחריו נקע צוואר הרחם, המתת 2-3 חודשים עכברי הריון מתזמן ביום עוברי 14. לרסס את הבטן של העכברים המתת חסד עם 70% ETOH. באמצעות ממחצויות לתפוס את הבטן התחתונה ולפתוח את חלל הבטן באמצעות מספריים כירורגיים. התחל לחתוך ליד המקום שבו המקציצות מחזיקות את הבטן, ביצוע חתכים לצדדית בכל צד עד דופן הבטן ניתן לקפל בחזרה ואת הרחם גלוי בבירור. באמצעות מספריים כירורגיות, לחתוך את שני קצות קרן הרחם. לאחר מכן מוציאים את הרחם ומלמקם בצלחת פטרי עם 1x HBSS. באמצעות מקצות ישרים מסירים בזהירות עוברים מהרחם. השאר עוברים בHBSS לאורך כל תהליך זה. באמצעות המקצצים או להב מיקרוטומי, ערפו במהירות את ראשם של עוברים על ידי חיתוך ליד הצוואר. מה שהופך את הרמה לחתוך ככל האפשר. תחת מיקרוסקופ לנתח, להעביר ראש עובר לצלחת פטרי יבש 50 מ”מ והמקום בצד האוורירי. לייצב את הראש עם מרטפיים על ידי הצבת ו חודר ליד העיניים / הנוהם. מפס צריך להיות בזווית כלפי מטה ב ~ 45 ° כדי למנוע חודר mesencephalon. באמצעות המפסים ביד השנייה, בזהירות להסיר את השכבה השקוף של העור והגולגולת ממש לפני הרכס הבולט של mesencephalon. התחל ליד קו האמצע ולהסיר את העור והגולגולת caudally עד mesencephalon חשוף לחלוטין. החזיקו את המקציות בניצב אל המנספלון החשוף עם קצה אחד בין קליפת המוח והמסנספלון והשנייה ליד המוח הקטן. לחץ למטה וצבוט את המכבשים יחד כדי להסיר את כל חומר האמצע. מקטע ה-midbrain צריך להיות בעובי של כ-0.5 מ”מ. מניחים את קטע המוח האמצעי בצלחת פטרי השנייה, מלאה ב-1x HBSS טרי. חזור על תהליך זה עבור כל עובר. באמצעות מיקרוסקופ הפירוק, מקם את קטע המוח עם הצד האוורני פונה כלפי פנים כלפי פנים. אם קרום המוח עדיין מחובר, בזהירות להסיר אותו על ידי תופס עם המפסים ומרים למעלה והרחק קטע המוח. לקטע המוח צריך להיות 4 רבעים נראים לעין. מניחים את הקטע באופן כזה ששני הרבעים הקטנים ממוקמים עדיפה על שני הרבעים הגדולים. יש רכס בולט המפריד בין שני הרבעים העילאיים (הקטנים) לרביעים תחתון משני הרבעים השירותים (הגדולים). שימוש במריצות צובט ומפריד את הרבעים העילאיים מהרביעים נחותים, ולאחר מכן השליכו את הרבעים המענים. לרביעים האחרונים יהיו עודפי רקמות לרוחב בצד הגב, הרקמה הזו תיראה פחות אטומה מהרקמה האוורירית הנותרת. הסר את רקמת הגב הפחות צפופה והשלך. המקטע הנותר צריך להכיל הן את ה-Substantia nigra pars compacta (SNc) והן את אזור הטגמנט הפתחי (VTA). באמצעות המלקות לחתוך את קטע רקמת גקון הנותרים לתוך 4 חתיכות קטנות יותר באמצעות פיפטה נשא 1mL רחב להעביר קטעים אלה בצינור חבוי 15 מ”ל עם 1x HBSS. שמור את הצינור החומור עם קטעי מוח על קרח לאורך כל ההליך. חזור על תהליך זה עבור כל קטעי המוח הנותרים. 4. ניתוב תאים עיכול אנזימטי של תאים בזהירות לשאוף את HBSS מן הצינור חריט 15 מ”ל המכיל מקטעים midbrain, עוזב את הקטעים בתחתית הצינור. להוסיף ~ 800 μL של תמיסת פאפין לצינור ולמקם ב אינקובטור 37 ° C במשך 7 דקות. התאים מחדש על-ידי הסטת הצינור והחלפה באינקובטור של 37°C למשך 7 דקות נוספות. עם קצה פיפטה 1 מ”ל מ”ל רחב להסיר רק את קטעי midbrain לתוך aliquot 1 mL של DNase. אפשר למקטעים להגיע לתחתית ה- aliquot או כ-1 דקות של חשיפה. עם קצה פיפטה 1 מ”ל רחב משעמם להסיר רק את מקטעים midbrain לתוך צינור חריט 15 מ”ל המכיל 2 מ”ל של פתרון עצירה. אפשר למקטעים להתיישב בתחתית הצינור ולחזור על הטיפה בצינור חרוכי נוסף מלא בתמיסת עצירה. טריטורציה מכנית של מתלי תאים בצינור שטיפה פתרון עצירה שנייה, באמצעות קצה פיפטה 1 מ”ל נשא רחב, פיפטה התאים למעלה ומטה 10 פעמים עד שאין מקטעי רקמות גדולים גלויים. חשוב להימנע מכך שטריטוריה עבור פירוק תאים מינימלי. לאט פיפט 300 μL של 4% פתרון BSA לתחתית של צינור חרס 15 מ”ל המכיל קטעי מוח. הסר בזהירות את קצה הפיפטה כדי לשמור על שכבת מתלה. צנטריפוגה ב 0.4 x g עבור 3 דקות. לאחר מכן בזהירות לשאוף את תאי supernatant וssspend ב 400 μL של תא תרבות בינונית. 5. ציפוי התאים הערה: בהתבסס על ניסיון, כ-100,000 תאים ברי קיימא לכל עובר נאספים. עכברים בהריון בני 2-3 חודשים מתוזמן בדרך כלל יש גדלי המלטה של 8-10 עוברים; לכן, אומדן גס עבור התשואה הכוללת של תאים לכל עכבר בהריון מתוזמן הוא כ 1 מיליון תאים. באמצעות hemocytometer מראש ספירת תאים ולאחר מכן לדלל את המתלים 2,000 תאים / μL באמצעות אמצעי תרבות התא. לערבב בקצרה. הסר כיסויים עם תמיסת למינין ממדרגה 2 מהאינקובטור ושאפתו את תמיסת המינין הנותרת מהכיסויים המצופים באמצעות ואקום. צלחת במהירות כדי למנוע את הכיסויים מייבוש לחלוטין. פיפט 100 μL (2.0 x 105 תאים / כיסוי) על כל כיסוי וממקמים צלי פטרי לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. בזהירות להוסיף 3 מ”ל של תא תרבות בינונית לכל מנה והמקום בחזרה לתוך 37 ° C אינקובטור. Preform חצי בינוני משתנה 2 פעמים בשבוע במשך 2 שבועות. 6. זיהום של תרבות התא ב 14 DIV עם אדנו הקשורים ויראלי (AAV) וקטורים עבור כל מנה להכין 1 מ”ל של סרום חינם DMEM בינוני עם 1 μL של hSyn-GCaMP6f AAV (1.0 x 1013 טטר) שאיפה לתרבית התא מדיום מכל מנה ולהחליף עם 1 מ”ל של DMEM סרום חינם המכיל hSyn-GCaMP6f. מניחים את המנות בחזרה לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. שאפף את המדיום ללא סרום המכיל טרקטורונים והחלף ב-3 מ”ל של מדיום של תרבות תאים. מניחים את הכלים בחזרה לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס. מצאנו כי 5-7 ימים של זיהום AAV מאפשר רמות אידיאליות של ביטוי GCaMP. המשך להשתנות מדיום כל 2-3 ימים במהלך תקופה זו של זיהום נגיפי. 7. חי confocal Ca2+ הדמיה בין 19-21 DIV הערה: כפי שהוזכר בשלב 6.3, הדמיה יכולה להיעשות בין 5-7 ימים לאחר זיהום נגיפי. זהו החלון האידיאלי להשגת ביטוי גלוי של הפלואורופור ברמות המאפשרות זיהוי של פעילות ספונטנית Ca2+ . הכנת מאגרי הקלטה כדי ליצור מאגר הקלטה של 1 L של HEPES, הוסף: 9.009 גרם של NaCl, 0.3728 גרם של KCl, 0.901 גרם של D-גלוקוז, 2.381 גרם של HEPES, 2 מ”ל של 1 M CaCl2 פתרון מניות, ו 500 μL של 1 M MgCl2 פתרון מניות ל 800 מ”ל של סטרילי מזוקק H2O. להביא את ה-pH ל 7.4 עם NaOH. תביא כרך אחרון של 1 L. כדי להפוך 200 מ”ל של 20 μM גלוטמט מאגר הקלטה, לדלל 40 μL של 100 mM גלוטמט פתרון מניות לתוך 200 מ”ל של מאגר הקלטה HEPES המתואר לעיל. כדי להפוך 200 מ”ל של 10 μM NBQX מאגר הקלטה, לדלל 200 μL של 10 mM NBQX פתרון מניות לתוך 200 מ”ל של מאגר הקלטה HEPES. הדמיה קונפוקל מלאו צלחת פטרי סטרילית 35 מ”מ עם 3 מ”ל של חוצץ הקלטה. הסר צלחת פטרי 35 מ”מ עם תרבויות נגועות מהאינקובטור 37 °C. בעזרת מקצות קצה עדינים, תפסו בזהירות את הקצה של כיסוי אחד והעבירו אותו במהירות לצלחת פטרי מלאה במאגר הקלטה. מניחים את הכיסויים הנותרים בחזרה לדגמה של 37 מעלות צלזיוס. להעביר את המנה עם מאגר הקלטה למיקרוסקופ confocal. הפעל את תוכנת ההדמיה. המשך לשלב הבא בעת אתחולו. הפעל את המשאבה פריסלטית והכנס את הקו למאגר ההקלטה. כיול מהירות הזרימה ל- 2 מ”ל/דקה. מעבירים את כיסוי הדם הנגוע מצלחת פטרי 35 מ”מ לאמבטיית ההקלטה. באמצעות המטרה טבילה מים 10x ואור BF, למצוא את מישור המיקוד ולחפש אזור עם צפיפות גבוהה של גופים תאי נוירון. עבור ליעד טבילה במים 40x ושימוש באור BF מיקוד מחדש את הדגימה. בחלון “רשימת צבעים” בתוך FluoView בחר AlexaFluor 488 ולהחיל אותו. ביטוי AAV יכול להיות משתנה; לכן, כדי למנוע חשיפת יתר ופוטו-בליך של הפלואורופורים, התחל עם הגדרות HV נמוכות וחשמל לייזר. עבור ערוץ AlexaFluor 488, הגדר את המתח הגבוה (HV) ל- 500, את הרווח ל- 1x, והוסט ל- 0. עבור קו הלייזר 488 להגדיר את הכוח ל 5%. על מנת להגדיל את עוצמת הקול היעילה התמונה z-plane, להגדיל את גודל חור הסיכה ל 300 μm. השתמש באפשרות הסריקה “focus x2” כדי לכוונן באופן אופטימלי אותות פליטה לרמות רוויית משנה. מכאן, ניתן לכוונן את ההגדרות עד להשגת ניראות אידיאלית של כל ערוץ.הערה: כדי ללכוד במדויק את הטווח המלא של שטף Ca2+ עם GCaMP, התאם את הגדרות HV ועוצמת הלייזר הבסיסיות כדי לאפשר עלייה בעוצמת הפלורסנט מבלי לכוון יתר על כן את הגלאי. לאחר אופטימיזציה של הגדרות מיקרוסקופ, להזיז את הבמה על מנת לאתר אזור עם תאים מרובים הצגת שינויים ספונטניים בפלואורסצינטי GCaMP6f ולהתמקד במישור הרצוי עבור הדמיה. השתמש בכלי “תיקון קליפ” כדי לחתוך את מסגרת ההדמיה לגודל שיכול להשיג מרווח מסגרות של קצת פחות משניה אחת. פעולה זו נחוצה כדי להגדיר את מרווח ההדמיה במסגרת אחת לשניה. הגדר את החלון “מרווח זמן” לערך של 1.0 ואת החלון “Num” ל- 600.הערה: על מנת לספק מאגרי הקלטה שונים בנקודת הזמן הרצויה (300 שניות), חשוב לכייל את ההיהיה של המשאבה כדי לספק את הפתרון החדש לאמבטיה. הדבר יהיה תלוי בקצב ההתזה של הפתרון (2 מ”ל/דקה) ובאורך הקו המשמש למשאבת פתרון. כדי ללכוד סרט מסדרת t, בחר באפשרות “זמן” ולאחר מכן השתמש באפשרות הסריקה “XYt” כדי להתחיל בהדמיה. צפה במחסום ההתקדמות של ההדמיה והעבר את הקו ממאגר ההקלטה HEPES למאגר ההקלטה של גלוטמט של 20 μM בנקודת הזמן המתאימה (לדוגמה, אם ההשהיה של המשאבה מכוילת כדי לספק פתרון ב- 60 שניות, העבר את הקו למאגר הגלוטמט ב- 240 מסגרות כדי לספק גלוטמט ב- 300 שניות). לאחר השלמת ההדמיה, בחר בלחצן סידרה הסתיימה ושמור את הסרט המוגמר מסדרת t. להמשיך להסתבות 20 μM גלוטמט במשך 5 דקות נוספות, כך נוירונים תרבותיים נחשפו גלוטמט במשך סך של 10 דקות. חזור על תהליך זה כדי שכל כיסוי יהיה תמונה. לאחר 5 דקות נוספות חשיפה 20 μM גלוטמט, להסיר את כיסוי מהאמבטיה והמקום בחזרה לתוך צלחת פטרי 35mm המכיל מאגר הקלטה עד יום ההדמיה הושלמה. בסיום, המשך לשלב 8. ניתוח מעקב Ca2+ בצע ניתוח תמונה ב- ImageJ. התקן את התוסף BIO-FORMATS עבור ImageJ, אשר יאפשר . קבצי תמונה OIB לפתיחה. בסרגל הכלים ImageJ, לחץ על נתח | הגדר מידותובחר את התיבה עבור ערך אפור ממוצע (MGV). ב- ImageJ, פתח סרט מסדרת T כעלם. גרור את המחוון עבור הסרט וזהה את המסגרת עם תגובת גלוטמט מקסימלית כדי לדמיין את כל הנוירונים המגיבים גלוטמט. השתמש בכלי מצולע כדי לעקוב אחר כל גופי תאי נוירון גלויים, הוספת ROIs שלהם לרשימת “מנהל ROI”. לאחר סיום המעקב וההוספה של ROIs, בחר את כל ה- ROIs בחלון ROI Manager והשתמש בבחירה מידה מרובה ברשימת האפשרויות היותר. העתק והדבק נתונים אלה בגיליון אלקטרוני. השלם תהליך זה כדי שניתחו את כל הסרטים. עבור כל החזר השקעה, המר את נתוני ה-MGV הגולמיים מכל מסגרת לערכי ƠF/F0 באמצעות המשוואה: ƠF/F0 = [F(t) – F0] / F0. כאשר F(t) = MGV של כל מסגרת נתונה, ו- F0 = MGV בסיסי ממוצע של ~ 10 מסגרות שבו אין Ca2+ שטף נוכח. באמצעות תוכנה סטטיסטית כגון OriginPro 2020, ניתן להפוך עקבותערך מומרים לגרפי קו. ניתן להשתמש בפונקציה “מנתח שיא” (או פונקציה דומה אם משתמשים בתוכנה אחרת) כדי למדוד את משרעת השיא של תגובת גלוטמט, ההשתהיה להגיב גלוטמט, ואזור מתחת לעקומה. 8. חיסון של תרבויות הערה: לאחר קיבעון עם פורמלין, כיסויים ניתן לאחסן 1x PBS ב 4 ° C עד מוכן לעיבוד עבור immunostaining. דגירה ראשונית ומשנית של נוגדנים נעשתה באופן סדרתי, כמו דגירה כזו עם נוגדן ראשי אנטי-Caspase-3 הנוגדן המשלים שלה הקדים דגירה עם הנוגדן הראשי anti-TH ואת הנוגדן המשלים שלה משני. מיד לאחר חשיפת גלוטמט, מניחים את הכיסוי בחזרה לצלחת פטרי 35 מ”מ, שואפים את מאגר ההקלטה ומוסיפים 3 מ”ל של 10% פורמלין. בואו לשבת 40 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לשטוף את המנה 3 פעמים עם 1pBS. לשאוף את PBS ולחלחל תאים ב 1 מ”ל של 0.01% Triton X-100 ב PBS במשך 2 דקות. לשטוף את המנה 3 פעמים עם 1pBS. שאף את תאי PBS וחסום ב- 1 מ”ל של 10% NGS ב PBS במשך 40 דקות. לשטוף את המנה 3 פעמים עם 1pBS. להוסיף 1 μL של נוגדן ארנב נגד Caspase-3 הנוגדן הראשי 1 מ”ל של 1% NGS ב PBS (1:1000 דילול). שאפף PBS מהצלחת ולהחליף עם פתרון הנוגדן העיקרי. מניחים על שייקר ותדנו במשך 1.5 שעה ב-RT. לשטוף את המנה 3 פעמים עם 1pBS. להוסיף 1 μL של עז נגד ארנב AlexaFluor 488 נוגדן משני 1 מ”ל של 1% NGS ב PBS (1:1000 דילול). שאפף PBS מהצלחת ולהחליף עם פתרון נוגדן משני. מניחים על שייקר ודגירה למשך שעה אחת ב-RT. לשטוף את המנה 3 פעמים עם 1pBS. חזור על שלבים 8.7 – 8.10, אבל באמצעות הנוגדן הראשי נגד TH עוף (1:1000) בשלב 8.7 ואת העז נגד עוף AlexaFluor 594 נוגדן משני (1:1000) בשלב 8.9. לאחר שטיפה PBS הסופי, למקם 30 μL של הרכבה בינונית על שקופית מיקרוסקופ. באמצעות מפלצות לתפוס כיסוי מצלחת פטרי 35 מ”מ ולמקם את כיסוי עם התאים עם הפנים כלפי מטה לתוך המדיום הרכבה. שני כיסויים יתאימו לשקופית מיקרוסקופ אחת אם ממוקמים כראוי. מניחים באזור יבש וחשוך ומאפשרים למדיום ההרכבה להתייבש בן לילה. 9. הדמיה קונפוקל של תרבויות חיסוניות הדמיה קונפוקל הפעל את תוכנת ההדמיה. מניחים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ. עם עיניות מיקרוסקופ, באמצעות יעד הגדלה 20x ואור epifluorescent עם מסנן TRITC, למקד את המדגם ולחפש גוף תא TH + . לאחר איתור גוף תא TH+ , מרכז אותו בשדה התצוגה ולאחר מכן עבור ליעד הגדלה של 60x. בחר את הצבעים AlexaFluor 488 ו- AlexaFluor 594 בחלון “רשימת הצבעים”. כמו בהדמיה חיה, התחל עם הגדרות צריכת חשמל נמוכות של HV, רווח, היסט ולייזר כדי למנוע פוטו-בליך. השתמש באפשרות הסריקה “מיקוד x2” כדי להעריך את עוצמת הפלורסנט של כל ערוץ ולהתאים בהתאם. מכיוון שתמונות אלה יכומתו מאוחר יותר לעוצמת פלורסנט, יש צורך לשמור על הגדרות ההדמיה עקביות בכל תחומי התצוגה. לכן, עדיף להסתכל על כמה דוגמאות של כל מצב כדי לקבל מושג על טווח עוצמת פלורסנט על פני דגימות. לאחר שנקבעו הגדרות הדמיה אידיאליות, בחר באפשרות הסריקה “focus x2” והעביר את תא העניין למרכז שדה התצוגה. הגדל את גודל התצוגה הדיגיטלית ל- 3x באמצעות המחוון “מרחק מתצוגה”. באמצעות ידית המיקוד, מצא את מישור המיקוד עם הפלואורסץ הבהיר ביותר וצלם תמונת XY של מישור יחיד. שמור את התמונה לסיום. חזור ליעד הגדלה של 20x כדי לחפש תא TH+ אחר. חזור על תהליך זה עד לדגום מספר התאים הרצוי מכל תנאי. ניתוח תמונות בסרגל הכלים ImageJ, לחץ על נתח | הגדר מידותובחר את התיבות עבור אזור, צפיפות משולבת וערך אפור ממוצע. פתח תמונה כעקמת יתר כאשר כל ערוץ מופרד על-ידי גרירה ושחרור בסרגל הכלים ImageJ או בחירת התמונה באמצעות תפריט הקובץ. השתמש בערוץ TH (594 דפים לשעה) כדי לצייר ROIs סביב גוף התא. בעזרת כלי המעקב מצולע ב- ImageJ, עקוב מקרוב אחר הקצה החיצוני של גוף התא. כאשר המרחק בין קרום התא לגרעין התא הוא הקטן ביותר, עקוב אחר קו ישר דרך הציטוסול עד לקצה הגרעין ולאחר מכן עקוב מקרוב אחר קווי המתאר של הגרעין כדי לא לכלול אותו. לאחר מכן עקוב אחר קו ישר בחזרה לממברנה החיצונית, הגובל בקו הראשוני קרוב ככל האפשר, והמשך לעקוב אחר קווי המתאר של גוף התא עד להשלמת ההחזר על ההשקעה. שימוש בקיצור המקשים “T” או שימוש בנתיב תפריט סרגל הכלים נתח | כלים ומידע | ROI Manager, פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה והוסף את ההחזר על ההשקעה שצויר זה נכון לרשימה. בחר את החלון של ערוץ caspase-3 (488 נה”מ) ולאחר מכן בחר את ההחזר על ההשקעה הנוספת ברשימה “ROI Manager”. בחלון מנהל ROI, בחר בלחצן מדידה. חלון התוצאות יופיע עם המידות שהוגדרו קודם לכן. העתק אותם בגיליון אלקטרוני וחזור על תהליך זה עבור כל תא.

Representative Results

לאחר ההתפלה הראשונית של תאים, טיפלנו במנות תרבות VM ב 14 DIV עם 1 μL של AAV hSyn-GCaMP6f ואפשר 5 ימים של ביטוי ויראלי. ביום של הדמיה HEPES הקלטה היה מוכן טרי. השתמשנו בשני תנאים. בתנאי אחד 20 μM גלוטמט הוחל עבור 10 דקות, בעוד בתנאי השני 5 דקות של 10 μM יישום NBQX קדם 10 דקות שיתוף יישום של 10 μM NBQX + 20 μM גלוטמט. בשני התנאים, הבחנו בשינויים הטרוגניים וספונטניים בפלואורסץ GCaMP6f, המציינים שטף ספונטני Ca2+ , כפי שמתואר בעקבות הנציג(איור 1A, B, סרט משלים 1.2). יישום של גלוטמט 20 μM יצר תגובה חזקה ומתמשכות Ca2+ הן באופן ספונטני פעיל וlyescent נוירונים(איור 1A, סרט משלים 1). יישום של 10 μM NBQX מופחת פעילות ספונטנית, וחסם חלקית את התגובהגלוטמט (איור 1B, תוספת סרט 2). המידה שבה יישום גלוטמט עורר תגובה Ca2+ בכל תנאי היה לכמת באמצעות אזור מתחת לעקומה, משרעת שיא, וההשתה להגיב. שני האזורים מתחת לעקומה ומשרעת שיא היו דומים הן גלוטמט NBQX + גלוטמט שטופלו תנאים(איור 1C),בעוד ההשתיה לתגובה גדל באופן משמעותי במצב NBQX + גלוטמט (איור 2A,B). בנוסף לכמת את התגובה Ca2+ לטיפול גלוטמט, תיקנו ומוכתמים דגימות עם נוגדן נגד קפסה-3 כמדד של אפופטוזיס בתיווך גלוטמט. ראינו טווח של הפעלה caspase-3 על פני התנאים(איור 3A,B). הפעלת Caspase-3 היה לכמת על ידי מדידת אזור ועוצמת caspase-3 אומר. בהשוואה לתאי בקרה לא מטופלים, האזור הממוצע של תאים עם הפעלה caspase-3 תחת גלוטמט ו NBQX + תנאי גלוטמט במגמה לקראת משמעות(איור 3B). עוצמת הקספס-3 הייתה גבוהה משמעותית בתנאי גלוטמט ו-NBQX + גלוטמט בהשוואה לפקדים לא מטופלים(איור 3B). יחד, תוצאות אלה מדגימות מסגרת תוכן גבוהה שבה אפופטוזיס של נוירונים ניתן למדוד על ידי כימות Ca2+ תגובות לסוכנים excitotoxic ואחריו עם ניתוח של אירועים אפופטוטיים במורד הזרם כגון הפעלה caspase-3 באותה קבוצה של תרבויות. איור 1: נוירונים מאסנפפליים גנוניים תרבותיים מציגים פעילות ספונטנית Ca2+ והם מגורה בחוזקה על ידי יישום גלוטמט. (א)עקבות מייצג של פעילות ספונטנית Ca2+ בנוירונים VM ותגובתם 20 μM גלוטמט יישום. (ב)נציג עקבות של פעילות ספונטנית Ca2+ בנוירונים VM ותגובתם 10 μM NBQX + 20 μM יישום גלוטמט. (ג)נתוני אוכלוסין המציגים אזור מתחת לעקומה ומשרעת שיא של Ca2+ עקבות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: מצור AMPAR עם NBQX מעכב את התגובה ליישום גלוטמט בנוירונים מאסנפפליים גקויים תרבותיים. (A)נציג Ca2+ עקבות של גלוטמט (אפור) ו NBQX + גלוטמט (כחול) עורר תגובות. ממוצע Ca2+ עקבות של גלוטמט (שחור) ו NBQX + גלוטמט (אדום) מוצגים overlaid. (ב)נתוני אוכלוסייה המציגים ההיהיה לתגובה עבור גלוטמט ו- NBQX + גלוטמט עוררו תגובות. שינוי אחוזים בין גלוטמט ו-NBQX + תנאי גלוטמט מוצג בחלונית הימנית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: יישום גלוטמט מגביר את הביטוי caspase-3 טירוסין hydroxylase (TH) נוירונים מאסנפפליים גחונים חיוביים. (א)תמונות קונפוקליות מייצגות של תרבויות VM מחוסנות עבור caspase-3 (ירוק) ו- TH (אדום), סרגל קנה מידה = 10 μm. (ב)נתוני אוכלוסין המציגים אזור DA neuron וערך אפור ממוצע של ביטוי caspase-3 בכל תנאי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. סרט משלים 1: פעילות ספונטנית Ca2+ ותגובה ליישום גלוטמט.ספונטני Ca2+ שטף בנוכחות מאגר הקלטה HEPES (0-300 s) ואחריו יישום של 20 μM גלוטמט (301-600 s). סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה. סרט משלים 2: פעילות ספונטנית Ca2+ ותגובה NBQX + יישום גלוטמט.שטףספונטני Ca 2+ בנוכחות מאגר הקלטה HEPES (0-300 s) ואחריו יישום של 10 μM NBQX (301-600 s), ו 10 μM NBQX + 20 μM גלוטמט (601-900 s). סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Discussion

אנו מתארים מערכת תרבות תאי מאסנפפלית (VM) ראשית לטווח ארוך לניתוח תוכן גבוה של אפופטוזיס בתיווך גלוטמט בנוירונים. מחקרים העסיקו תרביות דופאמין המוח האמצעי העיקרי כדי להכליל מנגנונים excitotoxic בהקשר של מודלים PD¹¹^,¹². במחקר זה, אנו משתמשים בגישה קומבינטורית באמצעות מחווני סידן מקודדים גנטית (GECIs) כדי למדוד פעילות Ca²⁺ ולשייך פעילות זו עם שינויים מולקולריים במורד הזרם, כגון חניכה של מפלים איתות אפופטוטי⁴. לשיטה יתרונות מרובים למערכות אחרות של תרבות תאים דומות. כפי שיש לנו עניין מיוחד ב-excitotoxicity בהקשר של מחלת פרקינסון, באמצעות תרביות תאי VM ראשי הוא אידיאלי. על ידי שימוש בטכניקות שונות רילוקיישן שדה, כגון כיסויים ממוסמרים או שלב מיקרוסקופ XY ממונע בשילוב עם TH immunostaining, אנחנו יכולים ישירות ללמוד את סוג התא השפעות ספציפיות של אפופטוזיס גלוטמט בתיווך גלוטמט בנוירונים אמצע המוח הגחוני. בנוסף, מודל תרבות התא 3 שבועות מאפשר נוירונים לפתח את הפרופיל המולקולרי המלא שלהם, בוגר, המשקף נוירונים DA למבוגרים⁹. שיטות קודמות התמקדו בעיקר בשינויים מולקולריים בעקבות excitotoxicity בתיווך גלוטמט¹³^,¹⁴. המודל הוא ייחודי ביכולתו לתאם שינויים אקוטיים בפיזיולוגיה עצבית עם אירועים מולקולריים במורד הזרם בסוגי תאים מזוהים. מגבלה אחת של מודל התרבות העיקרית היא כי טכניקת הניתור לוכדת את המוח האמצעי הגחני כולו, כולל DA ו נוירונים GABAergic, כמו גם נוירונים SNc ו- VTA. ראיות עכשיו עולה כי נוירונים DA של SNc יש פגיעות סלקטיבית סידן ובסופו של דבר מוות תאים בהשוואה לנוירונים DA של VTA^{השכן 15}. למרבה הצער, בידול SNc מנויונים VTA בתרבויות עובריות הוכיח קשה עם כמה ציוני דרך אנטומיים כדי להגדיר מבנים אלה במוח העוברי.

אנו מדגימים כי טכניקת התרבות העיקרית מאפשרת לכמת פעילות הטרוגנית ספונטנית Ca²⁺ (איור 1). לכן, זהו מודל אידיאלי של מערכת תרבות התא ללמוד תאים פעילים tonically, כגון נוירונים דופאמין קצב של המוח האמצעי, נוירונים neocortical, נוירונים GABAergic של הגרעין suprachiasmatic (SCN)¹⁶^,¹⁷. ברוב היישומים, Ca²⁺ הדמיה אינה משיגה את אותה רזולוציה זמנית כמו אלקטרופיזיולוגיה. לכן, סביר להניח כי אירוע Ca^{2+ יחיד} מקביל פרץ של פוטנציאל פעולה עצבית. זה יכול להתפרש אומר כי Ca²⁺ הדמיה מאפשרת אמצעים מדויקים יחסית של פעילות מתפרצת חריגה בתאי pacemaking ולכן מתאים מסך תוכן גבוה של Ca^{2 +- מוות}תאי excitotoxic בתיווך.

כדי להשיג ולתחזק פעילות^{ספונטנית Ca 2+} , חשוב לטפל בשתי נקודות מפתח בפרוטוקול. הראשון הוא צפיפות הציפוי של התאים לאחר הקטף. עבור נוירונים VM העיקריים, מחקרים קודמים השתמשו סביב 100,000 תאים /^{ס”מ 2}⁹^,¹⁰. התאמנו את הפרוטוקול כדי צלחת צפיפות של 200,000 תאים / ס”מ 2 , אשר יוצר^מגווןהטרוגני של פעילות ספונטנית ומגדיל את מספר נוירונים VM דופאמין נוכח על כל כיסוי. מאז נוירונים קצב שונים יש מאפייני^{ירי שונים 16}, צפיפות הציפוי צריך להיות מותאם אישית לסוג התא נחקר אופטימיזציה על מנת להשיג רמות אידיאליות של פעילות ספונטנית. השני הוא זמן הדגירה בעקבות זיהום נגיפי של AAVs. כמו צפיפות ציפוי, זה יהיה תלוי בהקשר הספציפי של שאלת המחקר וסוג AAV בשימוש. עבור AAV ספציפי בשימוש כאן, 5 ימים של דגירה בעקבות זיהום נגיפי הוא אידיאלי כדי להשיג את רמות ביטוי החלבון הרצוי, המאפשר שינויים דינמיים בפלואורסציט GCaMP על מנת להקליט Ca^{2+ פעילות.} גורמים רבים קובעים באיזו מהירות וביעילות AAV תבטא את המטען שלה, שרבים מהם נמצאים מחוץ לתחום השיטה הזו, אך בקצרה, חשוב לשקול את פעילות היזם ואת הקצב שבו חלבון המטען מתבגר ומתקפל.

יתרון נוסף של השיטה הוא שהיא מאפשרת גמישות ניכרת בפורמט, וקטורים ביטוי, שימוש בציוד הדמיה, ואת מגוון השאלות המדעיות שניתן לטפל. בנוסף, השיטה מאפשרת בירור במגוון רחב של שאלות ספציפיות המקיפות את ההתעוררות בתיווך גלוטמט ב-PD, ומודלים אחרים של תפקוד לקוי של מערכת העצבים. לדוגמה, excitotoxicity בתיווך גלוטמט כרוך קולטנים מרובים מפלים איתות⁵. על ידי שימוש בשיטה, כפי שהוכח עם חוסם AMPAR, NBQX באיור 1, ניתן לנתח רכיבים ספציפיים של תגובת גלוטמט excitotoxic ברמה פיזיולוגית ומולקולרית. סביר להניח, גישה דומה באמצעות מעכבים של מערכות שליח שני יכול לשמש כדי לקבוע את תרומתם לרגשות. בנוסף, AAVs בשימוש כאן יכול להיות מותאם לבטא GECIs עם יזמים ספציפיים לתא או חיישנים אופטוגנטיים AAV-הביע שיכול לשמש כדי למדוד פרמטרים אחרים כגון שחרור מוליך עצבי.

מלבד ניתוחים עובריים ראשוניים והדמיה קונקודית, חלק גדול מהפרוטוקול משתמש בכישורי מעבדה בסיסיים שלא דורשים הכשרה מיוחדת. לכן, המגבלות על המודל כוללות את הקושי של טכניקת הניתוח העוברי, משך הזמן שבו יש לתורבת את התאים כדי להגיע לבגרות, וגישה למיקרוסקופ קונפוקאלי, או לאביזר הדמיה דומה. היתרונות והגמישות הרבים של השיטה עולה על מגבלות אלה, מה שהופך את זה מודל אידיאלי ללמוד את התפקיד גלוטמט בתיווך excitotoxicity בהפרעות במערכת העצבים. לבסוף, מודל זה יכול להיות כלי יעיל כדי לסנן תרכובות רומן עבור אפקטים אנטי אפופטוטיים והיכולת שלהם לשמר את בריאות הנוירון DA.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

נתמך על ידי מענקים של האגודה האמריקאית למחלות פרקינסון (APDA) ו NIH R01NS15809-01 ל RS. אנו מודים טקסס A & M המכון לרפואה גנומית (TIGM) על מתן עכברים בהריון מתוזמן כדי ליצור תרבויות דופאמין ראשוני.

Materials

10% Formalin/PBS	VWR	100496-506
10X NA 0.3 water-immersion objective	Olympus	UMPLFLN10XW
12 mm circular cover glass No. 1	Phenix Research Products	MS20-121
20X NA 0.85 oil-immersion objective	Olympus	UPLSAPO20XO
35 mm uncoated plastic cell culture dishes	VWR	25382-348
40X NA 0.3 water-immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
60X NA 1.35 oil-immersion objective	Olympus	UPLSAPO60XO
Ampicillin (sodium)	Gold Bio	A-301-25
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044	50x stock
Binolcular Microscope	Kent Scientific	KSCXTS-1121
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030
Calcium Chloride (CaCl₂), anhydrous	Sigma-Aldrich	746495
Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase	Abcam	ab76442
Deoxyribonuclease I (DNase)	Sigma-Aldrich	DN25
D-glucose, andydrous	Sigma-Aldrich	RDD016
DMEM + GlutaMAX medium	ThermoFisher	10569010	500 mL
Equine serum	ThermoFisher	26050088	heat-inactivated
Fiber Optic Illuminator, 100V	Kent Scientific	KSC5410
Filter System, PES 22UM 250ML	VWR	28199-764
Fluoview 1000 confocal microscope	Olympus
Fluoview 1200 confocal microscope	Olympus
GlutaMAX supplement	ThermoFisher	35050061
Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594	Abcam	ab150176
Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594	Abcam	ab150077
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x	ThermoFisher	14175095	500 mL
HEPES	VWR	101170-478
HeraCell 150 CO₂ incubator	Heraeus (ThermoFisher)
ImageJ v1.52e	NIH
IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm	RWD	S12014-13
Kanamycin monosulfate	Gold Bio	K-120-25
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A7506
L-glutamic acid	VWR	97061-634
Magnesium Chloride (MgCl₂), andydrous	Sigma-Aldrich	M8266
MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz	Harvard Apparatus	70-2027
MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm	RWD	F11014-11
NBQX	Hello Bio	HB0443
Neurobasal medium	ThermoFisher	21103049	500 mL
Normal goat serum (NGS)	Abcam	ab7481
Origin 2020	OriginLab
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	Addgene	100837-AAV1	Titer: 1.00E+13 gc/ml
Papain	Worthington Biomedical Corporation	LS003126
Penicillin streptomycin	ThermoFisher	15140122	10,000 U/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x	ThermoFisher	10010049	500 mL
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4832
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957
Potassium Chloride (KCl), anhydrous	Sigma-Aldrich	746436
Pump Head Tubing Pieces For MPII	Harvard Apparatus	55-4148
Rabbit monoclonal anti-caspase-3	Abcam	ab32351
Sodium Chloride (NaCl), anhydrous	Sigma-Aldrich	746398
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	BioXtra, ≥99.5% (GC)
Time-pregnant female C57BL/6 mice	Texas A&M Institue for Genomic Medicine
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	500 mL
Wide-bore blue pipette tips P1000	VWR	83007-380

Referanslar

Marras, C., et al. Prevalence of Parkinson’s disease across North America. NPJ Parkinson’s Disease. 4, 21 (2018).
Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).
Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders. European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).
Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).
Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
Vieira, M., et al. Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation. Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).
Sebe, J. Y., et al. Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse. Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).
Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism. Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).
Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
Henley, B. M., et al. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).
Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors. Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).
Lavaur, J., et al. The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).
Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. Researching glutamate – induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).
Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons. Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).
Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).
Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).
Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).

Etiketler

Calcium Fluxes Dopaminergic Neurons Parkinson’s Disease Neuroprotective Compounds Primary Midbrain Neurons Calcium-mediated Apoptosis GCaMP6f HEPES Recording Buffer Glutamate NBQX Confocal Microscopy Peristaltic Pump

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Bancroft, E. A., Srinivasan, R. Quantifying Spontaneous Ca²⁺ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons. J. Vis. Exp. (163), e61481, doi:10.3791/61481 (2020).

כימות ספונטני Ca2+ שטף ואת ההשפעות במורד הזרם שלהם בעכבר ראשי נוירונים המוח האמצעי