近同步激光扫描在活细胞上的共和和原子力显微镜（康波卡尔）

1. 乐器、文化媒体、菜肴的制备 打开共体显微镜和原子力显微镜的电源，以及康波卡尔期间使用的其他相关仪器或设备。留出足够的时间让仪器在开始测量之前进行热平衡和稳定。通常，1 小时就足够了。 准备一个干净的，系统批准的，玻璃底的培养皿，并填补半满，但不超过三分之二满，与磷酸盐缓冲盐水（PBS），或类似清澈液体。该盘（称为”校准盘”）与样品盘分离，将用于定位和校准原子力显微镜 （AFM） 悬臂。注：重要的是液体是清澈的，具有低自荧光，以防止任何干扰荧光光谱。建议使用PBS，因为它模仿生物环境。 准备实验样品盘，使相关的液体已经填补了至少一半满。如果样品是荧光的，请确保被覆盖或在黑暗的地方，直到需要。使用镜头清洁剂和镜头擦拭清洁所有玻璃盘的底部。 为计算机硬盘上的共和和 AFM 创建数据存储文件夹。 2. 细胞或微生物的选择 为了产生细菌库存溶液，在5%CO2培养箱中，使用接种循环在15 mL的托德·休伊特酵母（THY）过夜（指数相）中接种链球菌突变菌。 在隔夜孵育完成前1小时，用1mL的聚-l-lysine溶液涂覆实验样品盘，或足以覆盖玻璃底盘的玻璃部分，并留在生物安全柜中1小时。设置后，吸气聚-l-lysine溶液，并用PBS冲洗餐具3倍。 经过18~24小时细菌孵育后，用1 mL的细菌悬浮液接种THY，直到达到0.6~0.7的光学密度（接种的典型值为3 mL的THY，每盘1 mL的细菌悬浮液）。在每个聚-l-lysine涂层的菜中加入1 mL的新细菌溶液，孵育1小时。在过去10分钟内，在每道菜中加入1 mL的绿色荧光膜污渍（浓度为1μM）。 用 PBS 冲洗每道菜 3 倍。在生物安全柜内的室温下，用约1 mL的4%半甲醛溶液轻轻固定细菌15分钟。固定后，用 PBS 冲洗每道菜 3 倍。 将人类胚胎肾脏（HEK）293细胞储存在液氮中。电镀前在 37°C 水浴下快速解冻。 在细胞培养培养基中加入1 mL的基膜基质溶液，并在37°C下孵育（5%CO2），1小时。吸溶液，用细胞培养培养剂洗碗。板所需的 HEK 293 细胞数（例如，每 35 mm 培养皿 100，000 个细胞），并添加 2 mL 的细胞培养基。然后，在37°C下孵育（5%CO2）细胞48小时。 48小时后，将2μL的荧光微管细胞骨架染料（浓度为1倍）加入每个细胞样品盘，孵育30分钟。吸进含有染料的溶液，用PBS洗涤细胞3倍，并加入2mL的细胞培养培养。 将1 μL的等离子膜染料（浓度为10μM）加入样品盘，孵育30分钟。用 PBS 清洗含有染料 3 倍的溶液，并加入 2 mL 的细胞培养培养。 将1μL的核酸染料（浓度为10 μM）溶液加入样品盘，孵育30分钟，从而对核进行反染色。用 PBS 清洗含有染料 3 倍的溶液，并添加 2 mL 的培养介质。 3. AFM 程序 单击计算机上的软件图标打开原子力显微镜 （AFM） 操作软件。 旋转到或插入低放大率空气目标（建议 10 倍或 20 倍）。在尖端降低和校准过程中，5 mm 或 5 mm 以上的长期工作距离是有益的。 如果尚未安装，安装所选的单元样本级。对于活样品，使用碟加热器将样品保持在所需的温度。 装载经过系统批准的清洁培养皿，该培养皿填充半满 PBS（在步骤 1.2 中准备）或类似透明液体（校准盘）。如果样品阶段具有内置扣子，请使用这些扣子，否则，请使用真空润滑脂来稳定样品。 为所需的数据收集选择适当的 AFM 悬臂，然后按照以下步骤安装。 使用手套，使用 AFM 芯片安装阶段、钳子和一个小螺丝刀将 AFM 芯片安装到玻璃块中。小心地将 AFM 芯片放在玻璃块上，并定向以使其居中。悬臂，加上AFM芯片的一小部分，应在安装块的可见、非不透明部分。 拧紧螺钉，用螺丝刀固定芯片，直到芯片紧贴着玻璃块。使用立体显微镜或手持式间谍玻璃检查 AFM 悬臂是否正确定向。根据需要进行调整。正确方向后，将玻璃块以正确的方向放入 AFM 头并锁定到位。注：玻璃块内的 AFM 芯片的方向非常重要，因此系统激光器可瞄准悬臂的背面并正确反射到光电探测器上。在放置过程中，请注意不要过度拧紧螺钉，因为此过程可能会导致 AFM 芯片、悬臂或尖端断裂。 使用共聚焦显微镜的亮场选项，使用对焦旋钮定位校准盘的底部。注意此 z 高度作为菜底与显微镜目标有关的值。 使用操作 z 步进电机的计算机上的 AFM 系统的电机控制面板，将 AFM 悬臂从样品向上移动 2000 μm。 用双手轻轻将带 AFM 芯片的 AFM 头放在样品舞台上，确保 AFM 头上的每个垂直点都牢固地固定在 AFM 舞台上指定的凹槽中。一旦 AFM 头就位，目视地看到悬臂支架离盘子有多近。如果它似乎太近，使 AFM 头接触或样品盘顶部 1 mm 范围内，则使用 z 步进电机将 AFM 尖端朝样品降低。 使用亮场照明，使用 AFM 软件上的 z 步进电机控制面板，缓慢地将 AFM 芯片降到玻璃盘的底部。在仪器平台上找到控制 AFM 头 x-y 或平面中运动的手动千分尺。在视野中校正 AFM 头，调整 AFM 悬臂在视野中的位置。 由于此时与菜底有关的位置未知，因此下部步骤为 100 ~ 200 μm，以避免将 AFM 尖端撞到培养皿中。通常，尖端需要降低 800 ~ 2000 μm。当尖端降低时，注意显微镜软件视图上出现阴影，这表明 AFM 尖端越来越接近菜底。 将增量减至 20 ± 50 μm。请务必使用共和软件上的 LUT 面板，在尖端降低到盘中时调整相机图像的查找表 （LUT）。继续使用小步骤降低 AFM 提示，直到它主要对焦。 确保尖端足够暗，以便可以看到尖端的一般形状并在视野中居中。还要确保尖端看起来模糊，这确认它还没有遇到菜底。 调整显微镜焦点，使尖端现在聚焦，同时牢记目标的工作距离。在移动到更高的放大目标之前，使用显微镜测量工具通过访问共和软件上的测量工具面板来收集 AFM 悬臂的宽度和长度。注意这些测量结果。注意：重要的是不要将目标撞入样品盘的底部，这还可能导致样品盘与 AFM 尖端接触，从而可能损坏样品盘。 如果存在，请移除激光滤光片，并确保 AFM 激光已打开，以便激光在光学元件中可见。 使用激光对齐表盘，将激光移动到视野中，并在 AFM 尖端附近移动。激光进入此位置后，更换激光滤光片。 使用激光定位表盘，将激光放在 AFM 尖端位于悬臂上的背面。此时，激光对准面板应读取大于 0.0 V 的总和信号。如果未获得总和信号，请使用手动控制的镜像旋钮调整镜像，直到屏幕上读取大于 0.0 V 的总和信号。 在 AFM 悬臂上，在所有方向上少量移动激光器，直到达到最大总和信号，但位置位于 AFM 尖端。设置激光位置后，使用手动控制的偏转表盘将垂直和横向偏转归零。 观察 AFM 软件上的激光对齐面板，并使用 AFM 头上的垂直和横向偏转旋钮，对齐探测器，使目标居中（十字线中心的红点），并且没有垂直或横向偏转。 打开 AFM 软件中的校准窗口。输入所有实验特定信息。校准前，请关闭共体显微镜光源并关闭 AFM 外壳（如果适用）以抑制来自室内灯光或房间振动的任何潜在噪音。然后按下校准按钮，自动允许系统校准尖端。校准完成后，悬臂 （N/m） 的刚度及其灵敏度 （nm/V） 将在校准面板中提供。请注意这些，供以后分析。 使用步进电机将 AFM 悬臂回缩至少 2000 μm。将 AFM 头从舞台上取下并拆下校准盘。旋转到或插入所需的目标。如果系统被编程为在目标之间保持相同的焦平面，将收回目标 10% 的工作距离。如果这是油目标，则将一滴浸入油放在目标的眼睛上。注：目标的缩回可降低目标在放置过程中接触样品盘的可能性。 要牢固地将样品盘固定到位，请使用棉签在样品级内样品环边缘周围涂抹少量真空润滑脂，或使用样品夹。小心地将样品盘装入样品阶段。 放置样品后，旋转几次，以确保通过润滑脂将盘子密封在样品架上。将目标提升到菜底，直到油刚刚在目标的眼睛上吸芯。 使用显微镜，没有 AFM 头在舞台上，聚焦成像系统，使样品聚焦。请注意此 z 高度，供参考。 小心地将 AFM 头更换到平台上。 使用 z 步进电机，将尖端朝下样品。降低 AFM 提示时，根据需要调整亮场图像中的查找表 （LUT）。降低尖端，直到几乎尖锐。使用手动操作的 AFM 尖端位置微米，移动 AFM 头，使 AFM 尖端位于视野中居中或居中。注：由于 AFM 的 z 高度在步骤 3.6 中之前已注意到，因此可以采取较大的步骤来降低 AFM 尖端，但是，油脂已添加到培养皿的底部，并可能向目标添加油，因此此值只是供参考。建议采取 50 × 100 μm 的步骤，并在尖端进入焦点时调整较小 使用 AFM 头上的手动千分尺重新调整激光位置。如果需要，通过调整各自的旋钮并在样品盘中重新校准 AFM 悬臂，使垂直和横向偏转归零。注：如果悬臂在与样品不同的介质中校准，则必须在扫描介质中重新校准，以考虑折射率的潜在变化。此外，由于噪音或温度变化，激光可能会从悬臂的背面漂移。仅根据需要重新调整激光并重新校准，并在使用非接触式校准时在玻璃基板上方的样品盘中重新校准。如果使用接触校准，则使用样品介质重新校准校准盘内部。 为了实现高质量的共和显微镜图像，请用阻挡所有 AFM 激光激光的滤光片替换当前衰减光滤光片。此滤光片可确保 AFM 激光器的明亮光线不会干扰。 使用自动方法命令按钮（通常由朝下箭头表示）将尖端降到样品盘的底部。在成像控制面板上设置扫描的大小/面积、分辨率、设定点、z 长度和像素时间（或使用校准/传播值），并开始扫描。 扫描完成后，将 AFM 芯片提升 50 ~ 100 μm，然后导航到样品盘中的新测量位置。找到新位置后，接近玻璃，然后按照步骤 3.21 和 3.22 再次开始扫描。 选择” 自动保存” 选项，或通过单击”保存”，从每个单独的扫描中手动保存每个生成的 文件。 4. 共和程序 打开共和操作软件。确保所有相关的外设、光源和控制器都已打开并正常工作。 旋转或插入低放大率（10 倍或 20 倍）的物体以查看样品。确保目标与样品盘位于安全工作距离，如果需要，将目标备份，以避免目标与样品发生任何潜在碰撞。使用棉签，在样品盘环边缘涂抹真空润滑脂。如果使用油目标，将一滴浸入油放在目标的前透镜上 将所需样品放入样品阶段。旋转样品几次，以确保真空润滑脂与样品级插入或使用样品夹产生紧密粘结。如果使用油目标，将目标提升到盘子的底部，使油只是芯在玻璃底部。为了避免过度漂白，请尽量减少环境照明。 使用通过相机或目镜的亮场或荧光模式，定位样品并使用对焦旋钮，聚焦在包含多个细胞或单个单元的感兴趣区域。通常，光学显微镜内的视场将大于 AFM 系统上的 x-y 扫描窗口（100 x 100 μm）。使用 AFM 软件中的电机控制面板，调整共声视野内的 AFM 位置，使 AFM 扫描和共声光学成像相同的功能。注：在视野中，通常只有几个单元格，因此更容易确定需要哪个单元格来探测。在进行 AFM 时，该单元在 AFM 软件上变得可见，用户可以从那里确定要探测的特定感兴趣区域。 如果需要，使用基于样品标签的相机或 CLSM 模式，在亮场或荧光中捕获图像，并基于显微镜软件上的对焦旋钮和捕获按钮。 使用显微镜软件，选择选项或打开面板以启用共合功能（例如，激光和随后的参数）。此选项通常由激光线波长值显示。 选择适用于用于染色样品的染料的激光线。打开一条或多条激光线，以激发和成像样本中的这些特征。 将增益设置为优化样品荧光但限制噪声量的值。典型的起始值是增益 70。 调整激光功率以避免饱和像素，但最大化动态范围。激光功率的典型起动范围为 1 ~ 3 %。 将针孔尺寸设置为 1 个 Airy 单元，以最大限度地提高光学剖面的分辨率。如果样品变暗且激光功率已高，则打开针孔以增加信号，但代价是降低 z 轴分辨率。 设置像素停留时间（即扫描速度）。从 2 μs 停留时间开始，如果需要，调整以反映样品亮度。通过让仪器通过奈奎斯特选项按钮和图像中所选的像素数来计算所选目标的像素大小/扫描大小。注：在收集 z 堆栈时，较厚样品的停留时间较长会导致过度漂白。 选择仪器 软件上的”扫描”选项并开始数据收集。注：如果仪器有多个激光器，每个激光器都可以独立优化，然后同时运行多荧光图像。 使用对焦旋钮放大和缩小，并在样品中找到最佳视野。 使用系统的”捕获”按钮 捕获图像 ，并保存示例的所有必要文件格式到计算机硬盘驱动器或本地外部硬盘驱动器上所需的位置/文件夹。 继续相应地调整增益、激光功率、针孔尺寸、采样率和其他值，以优化图像。可以激活像素饱和度索引，以检查像素是否过度饱和。如果存在这种超饱和度，可以重新调整增益和激光功率以消除饱和像素。使用 LUT 作为指南进行特定调整。 如果可能，请使用系统的奈奎斯特采样率（在软件中显示为面板或按钮），以确保以最大可获得分辨率收集图像。 激活共和系统的 z 堆栈或图像卷收集工具。使用从下到上选项，只有一条激光线，特别是最清晰的激光线，为要测量的体积设置开始和完成平面。 使用 z 堆栈中平面之间的建议间距，该间距计算为满足奈奎斯特采样标准，以获得仪器和使用的激光线提供的最佳可获得的轴向分辨率。 当使用多条激光线时，使用最短波长计算间距。采集完成后，将文件保存到相应的文件夹中。 或者，如果 存在对样品厚度 的先验知识，则通过选择中间平面来定义体积，中间平面是显示最亮和最锐利的平面。在这种情况下，将顶部设置为中间平面上方的样本厚度的一半，将底部设置为中间平面下方的一半厚度。 此视图字段中的样本收集完成或样本已漂白后，使用电动或手动控制的阶段在样本上查找其他感兴趣的位置，并重复图像收集的步骤。 5. 清理程序 确保 CLSM 和 AFM 的所有数据文件都保存到正确的位置。 使用 z 步进电机至少 2000 μm 或到达样品表面的距离收回 AFM 芯片。将 AFM 头从舞台上拆下，并小心地放在其静止位置。 收回显微镜目标，使它远离样品。如果使用油目标，目标应收回足够远，以便目标与样品基板之间不再接触。 使用手套，取出样品，从样品盘底部清除润滑脂和油（如果适用）。获得一个新的，干净的，空的培养皿，并填补70%乙醇溶液的一半到四分之三满。将其放入样品架中，更换 AFM 头，使 AFM 芯片在乙醇溶液中浸泡 5 分钟。 当 AFM 芯片浸泡时，建议开始将实验数据复制到外部硬盘驱动器上。将AFM芯片浸入乙醇溶液中至少5分钟后，取出AFM头并将其放在其静止位置。 使用手套，拆下 AFM 芯片支架并将其放入安装站。使用带橡胶手柄的钳子小心地取出 AFM 芯片。将用过的尖端放回来自轴外方向的框的位置，以表示已使用。供将来参考，请注意实验中使用的提示。 将装满乙醇溶液的培养皿从系统中拿出来，处理液体和盘子。使用手套、镜头清洁剂和镜头擦拭，按照标准协议轻轻清洁显微镜目标上的空气。通过清除任何润滑脂清洁样品架。根据生物安全协议处理所有废料，并返回已知位置的工具。 完成从计算机收集数据并关闭它们。关闭用于实验的所有仪器、附件、外设或其他设备的电源。