Özet

Анализ РНК-блотов для обнаружения и количественной оценки микроРНК растений

Published: July 11, 2020
doi:

Özet

Этот метод демонстрирует использование метода северной гибридизации для обнаружения miRNAs от общего экстракта РНК.

Abstract

МикроРНК (miRNAs) являются классом эндогенно выраженных некодирующих, 21 nt малых РНК, участвующих в регуляции экспрессии генов как у растений, так и у животных. Большинство миРНК действуют как отрицательные переключатели экспрессии генов, нацеленные на ключевые гены. В растениях первичные миРНК (pri-miRNAs) транскрипты генерируются РНК-полимеразой II, и они образуют различную длину стабильных структур стволовых циклов, называемых премиРНА. Эндонуклеазы, Dicer-like1, обрабатывает премиРНК в дуплексы миРН-миРНАЗ. Одна из нитей из дуплекса miRNA-miRNA выбирается и загружается на белок Argonaute 1 или его омологи, чтобы остеклеть расщепление мРНК. Хотя миРНК являются ключевыми сигнальными молекулами, их обнаружение часто осуществляется менее оптимальными методами на основе ПЦР вместо чувствительного северного анализа помарки. Мы описываем простой, надежный и чрезвычайно чувствительный северный метод, который идеально подходит для количественной оценки уровней миРНК с очень высокой чувствительностью, буквально из любой ткани растений. Кроме того, этот метод может быть использован для подтверждения размера, стабильности и обилия miRNAs и их предшественников.

Introduction

Недавнее открытие небольших регуляторных РНК, микроРНК, привело исследования в понимании их и их роль в растениях и животных1. Длинные прекурсоры miRNAs обрабатываются в 21 до 24 nt зрелых miRNAs HYL1 и конкретных dicer-как белки2,3. 22 nt miRNA может инициировать каскадное заглушение, генерируя вторичные siRNAs4. Исследования показали роль miRNAs и вторичных siRNAs в развитии, судьба клеток и стресс ответы5,6.

Северная гибридизация является экспериментальным методом, обычно используемым для обнаружения конкретных молекул РНК. Этот метод настраивает его использование в обнаружении примерно 19 -24 nt длинных малых РНК из пула общего RNAs7. В этой демонстрации мы иллюстрируем использование этого метода для обнаружения и количественной оценки миРНК. Этот метод использует маркировку зондов с использованием радиоизотопов; таким образом, уровни миРНК в образце могут быть обнаружены с повышенной чувствительностью. В отличие от методов на основе ПЦР, этот метод обеспечивает количественную оценку экспрессии, а также определение размера miRNAs. В этом протоколе мы показываем важные шаги, которые улучшают обнаружение miRNA. Мы модифицировали шаги в blotting и гибридизации для получения высокого разрешения обнаружения сигнала miRNAs. Этот метод также может быть использован для обнаружения других эндогенных малых РНК, таких как siRNAs, tasi-вторичных РНК и snoRNAs.

Protocol

1. Приготовление 15% денатурированного полиакриламида гель Взвешивать и добавлять 4,8 г мочевины, добавить 3,75 мл 40% акриламида: бисакриламид (19:1) раствор и 1 mL 10x TBE pH 8.2 в стерильную трубку 50 мл. Растворите мочевину с помощью водяной ванны, установленной при 60 градусов по Цельсию, в ?…

Representative Results

В этой демонстрации, мы обнаружили и количественно выражение miR397 в различных тканях риса Indica var whiteponni (Рисунок 1). miR397 является 22 nt miRNA и сохраненной миРНК. Выражение miR397 можно обнаружить во всех проверенных образцах. Согласно данным секвенирования следующего по?…

Discussion

Этот метод может широко использоваться для обнаружения и количественной оценки малых РНК, включая менее обильные миРНК. Протокол в основном описывает шаги для денатурации общей РНК в погрузочном буфере, разделение размера гелевым электрофорезом, перенос РНК к мембране, перекрестная с…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признают доступ к радиационной лаборатории, предоставленной принимающим институтом и BRIT для радиоизотопа. Лаборатория ПВС поддерживается Национальным центром биологических наук, Институтом фундаментальных исследований и грантов Тата (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) от Департамента биотехнологии, правительство Индии. Депутат признает DBT-исследования ассоциированных, DBT, правительство Индии.

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution Sigma A9926
Ammonium persulphate (APS) BioRad 1610700
Blotting paper whatmann blotting paper I 1001-125
Bromophenol blue Sigma B5525-5G
Capillary loading tips BioRad 2239915
Deionized formamide Ambion AM9342
Heating block Eppendorff 5350
Hybond N+nylon membrane GE RPN203B
Hybridization bottle Sigma Z374792-1EA
Hybridization Oven Thermo Scientific 1211V79
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma T7024-25ml
PhosphorImager GE- Typhoon scanner 29187194
PhosphorImager screen and cassette GE healthcare GE28-9564-75
Pipettes Gilson, models: P20 and P10 FA10002M, FA10003M
Plastic pipette Falcon 357550
Polyacrylamide gel apparatus BioRad 1658003EDU
Sephadex G-25 column GE healthcare 27532501
Speed Vac Concentrator Thermo Scientific 20-548-130
Spinwin Tarsons 1010
T4 Polynucleotide Kinase (PNK) NEB M0201S
Transblot apparatus BioRad 1703946
ULTRAHyb hybridization buffer Ambion AM8670
Urea Fischer Scientific 15985
UV-crosslinker UVP CL-1000L
Vortex Tarsons 3020
Water bath NEOLAB D-8810
Xylene cyanol Sigma X4126-10G

Referanslar

  1. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
  2. Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
  3. Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
  4. Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
  5. Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
  6. Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
  7. Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
  8. Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
  9. Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
  10. Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Tirumalai, V., Prasad, M., Shivaprasad, P. V. RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs. J. Vis. Exp. (161), e61394, doi:10.3791/61394 (2020).

View Video