Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

NOTA: Todos los estudios en animales fueron autorizados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación Lerner de la Clínica Cleveland. 1. Preparar los medios y suministros para la disección NOTA: Todas las recetas de búfer y medios se proporcionan en la Tabla 1. Este procedimiento se realiza en condiciones estériles en un cultivo de tejidos designado gabinete de bioseguridad. Preparar y filtrar estérilmente los medios gliales mixtos (MGM). Esto se puede hacer el día anterior y se almacena a 4 °C. Diluir la fibronectina a una concentración de 1:100 conH2Oestéril. El volumen de fibronectina diluida dependerá del número de cachorros y la región del SNC utilizada para el experimento. Utilice un matraz T25 para 1 corteza, un matraz T25 para 2-4 cerebella, un matraz T25 para 2-4 troncos cerebrales y un matraz T25 para 2-4 médula espinal.NOTA: La combinación de tejido de la misma región utilizando los criterios enumerados anteriormente permitirá una disociación adecuada sin alterar el protocolo descrito a continuación. La combinación de más tejido del descrito en el Paso 1.2 requerirá una mayor optimización de las concentraciones de reactivos de disociación. Pipetear 3 ml de fibronectina diluida en matraces T25 a temperatura ambiente y dejar reposar durante 2 min. Aspirar la fibronectina y dejar que los matraces se sequen durante la noche con la tapa del matraz aflojada. 2. Disección de corteza, cerebelo, tronco encefálico y médula espinal NOTA: Este procedimiento se puede realizar en la mesa de trabajo y requiere un alcance de disección. Use una técnica aséptica estricta para todos los pasos del procedimiento y minimice la exposición del tejido al aire ambiente. Mantenga todos los medios fríos en hielo durante la disección para garantizar la máxima preservación del tejido. Alternativamente, este procedimiento podría realizarse en una campana que permita el uso de un alcance de disección interna. Limpie todas las áreas con etanol al 70%. Pipetear 10 ml de PBS/solución antibiótica (PAS) en una placa de Petri de 10 cm. Prepara una placa de Petri para cada cachorro a diseccionar. Coloque en hielo para mantener la solución fría. En una campana de cultivo de tejidos desinfectada, pipetear 9 ml de DMEM (sin aditivos) en 4 tubos cónicos separados de 15 ml, uno para cada región del SNC, reemplazar las tapas de los tubos y poner en hielo. Coloque el cubo de hielo con tubos a una distancia de alcance del alcance de la disección. Colocar una placa de Petri de 10 cm preparada en el paso 2.2 en la etapa de endoscopio de disección desinfectada. Anestesiar y sacrificar a la cría de ratón de acuerdo con el protocolo institucional y retirar la cabeza por decapitación rápida con tijeras afiladas.NOTA: Día postnatal (P) Se utilizan 3-5 cachorros. Los cachorros mayores tienen un SNC más desarrollado y pueden no ser una fuente adecuada de células gliales en expansión. Los cachorros más jóvenes (P) 0-2 pueden producir un mayor número de glía y pueden ser utilizados; Sin embargo, el tejido de la médula espinal es muy difícil de diseccionar a esta temprana edad debido al tamaño. Limpia la piel del cachorro con etanol al 70%. Usando tijeras finas, cortar la capa cutánea a lo largo de la línea media de la cabeza del animal, comenzando caudalmente y moviendo rostral, hasta llegar al hocico. Evite cortar profundamente en el cráneo para evitar cualquier daño tisular. Inclinando la cabeza hacia abajo, tire de la capa cutánea a cada lado del cráneo y usando tijeras de resorte, haga una incisión a lo largo de la línea media del cráneo, comenzando en el foramen magnum, nuevamente cortando caudal a rostral. Con pinzas de punta fina, tire de las mitades del cráneo hacia los lados derecho e izquierdo, exponiendo la corteza, el cerebelo y el tronco encefálico. Una vez expuesto, levante suavemente el cerebro fuera del cráneo y dentro de la placa de Petri de 10 cm preparada en el Paso 2.2. Asegúrese de que el cerebro permanezca intacto para preservar la estructura anatómica, con el cerebro posterior unido. Usando pinzas finas de punta curva con la punta de los fórceps hacia arriba, pellizque el cerebelo. Retire las meninges y colóquelas en un tubo cónico designado de 15 ml en un cubo de hielo. Asegúrese de que el tronco encefálico sea directamente ventral al cerebelo y sea visible después de la extracción del cerebelo. Retírelo con pinzas de punta fina, retire las meninges y colóquelo en un tubo cónico designado de 15 ml en un cubo de hielo. Separe el mesencéfalo de la corteza, retire las meninges corticales y colóquelo en un tubo cónico designado de 15 ml en un cubo de hielo. Para extirpar la médula espinal, coloque el cachorro de ratón decapitado en posición supina (acostado boca arriba) con la columna vertebral cortada elevada hacia el investigador. Rocíe nuevamente con etanol al 70%. Cortar a lo largo de los lados laterales de la columna vertebral, en dirección rostral a caudal, a través de la caja torácica hasta llegar a las extremidades posteriores. Mientras corta, empuje hacia atrás los órganos internos hasta que la columna vertebral sea visible. Cortar a lo largo de cada lado lateral de la columna vertebral hasta aislarla y colocar en la placa de Petri de 10 cm preparada en el paso 2.2. Con el lado ventral hacia arriba, utilizando tijeras finas de resorte, alterna el corte de los lados derecho e izquierdo de cada vértebra hasta llegar a la región lumbar para exponer el tejido de la médula espinal. Retire suavemente la médula espinal y las meninges con pinzas de punta fina bajo el microscopio de disección. Coloque en un tubo cónico designado de 15 ml en cubitera. Repita los pasos 2.5.-2.19 para cada cachorro, combinando tejido de la misma región para ajustarse a los criterios descritos en el paso 1.2 para cada matraz T25 preparado.NOTA: Retire las meninges lo más completamente posible. Si queda una cantidad significativa de meninges, el fenotipo similar a los fibroblastos de las células meníngeas crecerá y abrumará el cultivo celular. Múltiples médulas espinales, de igual fenotipo, se pueden combinar para generar un cultivo celular específico. Tenga cuidado de asegurarse de que no se produzca un hacinamiento de las células, lo que puede conducir a la apoptosis glial y fenotipos diferenciales. 3. Disociación tisular NOTA: Todos los siguientes procedimientos se llevan a cabo en un cultivo de tejido estéril designado gabinete de bioseguridad utilizando técnica aséptica y materiales estériles. Agregue 1 ml de tripsina al 0,05% que contenga 0,53 mM de EDTA a cada tubo cónico de 15 ml de 9 ml de DMEM y tejido para comenzar la lisis tisular.NOTA: DMEM contiene una alta cantidad de cloruro de calcio, que puede actuar como un inhibidor de la tripsina. Si la disociación no se completa siguiendo los pasos descritos, se puede usar la solución salina equilibrada de Hanks sin calcio ni magnesio. Después de la tripsinización, la enzima puede neutralizarse agregando un inhibidor de tripsina, aunque el calcio debe agregarse nuevamente a la solución, ya que es un cofactor para la DNasa I, que se usa en los pasos posteriores. Triturar con una pipeta de 10 ml aproximadamente 20x. Transfiera las suspensiones celulares a tubos cónicos vacíos de 50 ml. Incubar la solución a 37 °C, 5% deCO2 durante 15 min, agitando suavemente los lisados después de 8 min. Agregue 5 ml de MGM y 200 μL (5 mg/ml) de DNasa I a cada tubo para obtener una concentración final de 50 μg/ml. Triturar cada lisado con una pipeta de 10 ml 10x. Deje que las suspensiones celulares reposen durante 3 minutos a temperatura ambiente para permitir que el tejido no disociado se asiente en la parte inferior de los tubos. Transfiera las suspensiones celulares a nuevos tubos cónicos de 50 ml, dejando atrás el tejido no disociado.NOTA: Los pasos de lisis y trituración descritos anteriormente limitan significativamente la cantidad de tejido no disociado. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 3 min a 4 °C sin freno. Aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos celulares restantes en 5 ml de MGM. Triturar el pellet con una pipeta de 5 ml 20x. Colocar en placa las suspensiones de 5 ml de células en matraces T25 recubiertos. Incubar las células a 37 °C, 5% deCO2 y cambiar de medio inicialmente después de 24 h para eliminar los restos celulares.NOTA: Algunos protocolos recomiendan un cambio inicial de medios después de 72 h. Es posible que sea necesario optimizar este paso. Realizar un cambio de media del 100% con MGM cada 48-72 h hasta que las células sean 80% confluentes (aproximadamente 5-7 días).NOTA: Todos los soportes deben calentarse a 37 °C antes de que cambien los medios. 4. Aislamiento de microglía Una vez que los cultivos gliales mezclados hayan alcanzado el 80% de confluencia, prepare los matraces para agitar apretando las tapas y sellando con una película de parafina. Para eliminar la microglía de cultivos gliales mixtos, fijar los matraces horizontalmente en un agitador orbital dentro de una incubadora a 37 °C. Agitar matraces a 15 x g durante 1 h. Retire el medio y la pipeta en un tubo cónico de 15 ml. Enjuague los matraces dos veces con 3 ml de MGM caliente, agregando lavado a los tubos cónicos de 15 ml. Estas son las microglías. Agregue 5 ml de MGM caliente y fresco a los matraces de cultivo. Volver a sellar los matraces con película de parafina, fijar los matraces horizontalmente en el agitador y agitar a 15 x g a 37 °C durante 15 h para separar los OPC de los astrocitos.NOTA: Este paso se puede hacer durante la noche, pero el tiempo de agitación de 15 h es crítico ya que el exceso de tiempo puede provocar la muerte celular. Centrifugar el sobrenadante a partir del paso 4.3. a 300 x g durante 3 min y cultivo de microglía según protocolos estándar16 o uso para un ensayo biológico. 5. Aislamiento de células precursoras de oligodendrocitos NOTA: Al chapar OPC después del aislamiento inicial, deben estar chapados en una superficie recubierta de poli-D-lisina (placa estéril o cubreba). Prepare estos materiales antes de completar esta sección. Después de agitar 15 h, retirar el sobrenadante de los matraces y colocar en placa una placa de Petri estéril de 100 mm. Incubar el sobrenadante a 37 °C, 5% deCO2 durante 30 min, agitando después de 15 min para eliminar la microglía restante, ya que estos se adherirán muy rápidamente al plato. Se pueden usar placas de Petri no tratadas con cultivo de tejidos para este paso. Retire el sobrenadante celular no adherente, el recuento y la placa en una superficie recubierta de poli-D-lisina. Normalmente, 7.500-10.000 OPC están chapados/cm2. Incubar a 37 °C, 5% deCO2 durante al menos 1 h (hasta 6 h), luego aspirar suavemente el 95% de los medios y agregar lentamente medios OPC calientes, pipeteando los medios contra la pared del pozo para minimizar la interrupción de los OPC. Cambie los medios cada 48 h hasta que las celdas estén listas para su uso.NOTA: Es fundamental que solo se cambie un pozo a la vez. Los OPC son sensibles y son especialmente intolerantes a las condiciones secas. La adición de PDGF-AA en medios OPC es para retrasar la maduración de OPC en oligodendrocitos. Este factor puede excluirse de los medios de cultivo si el foco experimental son los oligodendrocitos maduros. 6. Aislamiento de astrocitos Después de 15 h de agitación, retire el sobrenadante y enjuague los matraces 2x con 1x PBS tibio. Añadir 4 ml de tripsina al 0,05% que contenga 0,53 mM de EDTA e incubar a 37 °C, 5% deCO2 durante 5 min o hasta que las células se hayan levantado. Para asegurarse de que los astrocitos se hayan levantado, visualícelos usando un microscopio estándar de campo amplio. Los astrocitos aparecerán esféricos después de la tripsinización. Una vez que los astrocitos se hayan desprendido, coloque el matraz verticalmente y agregue 4 ml de MGM. Triturar para mezclar. Pipetear los astrocitos en un tubo cónico de 15 ml, centrifugar a 300 x g durante 5 min. Resuspender los astrocitos en medios de astrocitos y placa en la superficie recubierta de fibronectina como se describe en el paso 1.2. o uso para ensayo biológico.NOTA: Se pueden agregar 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos murinos durante el primer cambio de medios para ayudar a establecer el cultivo de astrocitos. Además, el recubrimiento de gelatina estándar puede ser una alternativa de bajo costo a la fibronectina. 7. Identificación y aislamiento de microglía, OPC, astrocitos y oligodendrocitos maduros mediante inmunocitoquímica Una vez que las células en placa hayan alcanzado la confluencia adecuada, retire suavemente los medios y fije las células adherentes con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 10 minutos. Haga este paso en un gabinete de bioseguridad.NOTA: Al aspirar o añadir soluciones, pipetear con una presión suave para evitar el desprendimiento de células. Aspire lentamente PFA y luego lave las células 3x con 1x PBS durante 5 min. Prepare la solución de bloqueo adecuada utilizando suero al 10% y Triton X-100 al 0,1% en 1x PBS.NOTA: La fuente de suero refleja el animal huésped en el que se crió el anticuerpo secundario. Por ejemplo, si el anticuerpo secundario es anti-conejo de cabra, el suero de bloqueo apropiado es suero de cabra normal. Del mismo modo, si el anticuerpo secundario es anti-conejo burro, el suero de bloqueo debe ser suero de burro normal. Agregue solución de bloqueo hasta que las células estén completamente cubiertas. Bloquear durante 1 h a temperatura ambiente. Preparar una solución diluyente de anticuerpos (9 ml de 1x PBS, 0,01 g de albúmina sérica bovina, 30 μL Triton X-100). Alternativamente, los anticuerpos pueden diluirse en la solución bloqueante descrita en el paso 6.3. Diluir anticuerpos primarios específicos para lo siguiente en diluyente de anticuerpos o solución bloqueante:Microglia: molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (Iba1) en una dilución 1:250 (2,4 μg/ml). OPC: antígeno neuronal/glial 2 (NG2) en una dilución 1:200 (5 μg/mL). Oligodendrocitos maduros: proteína básica de mielina (MBP) en una dilución 1:400 (la concentración depende del lote y puede ser necesaria la optimización). Astrocitos: proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en una dilución 1:400 (0,25 μg/mL)17.NOTA: No mezcle anticuerpos primarios criados en la misma especie.NOTA: GFAP etiquetará de manera confiable los astrocitos de la sustancia blanca. Para los astrocitos de materia gris, puede ser necesario usar un marcador alternativo. Incubar el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C (es preferible agitar suavemente). Lave 3x con 1x PBS durante 5 minutos para eliminar el anticuerpo primario. Incubar células con anticuerpos secundarios apropiados en una dilución 1:400 en diluyente de anticuerpos o solución bloqueante protegida de la luz.NOTA: Los anticuerpos secundarios se conjugan con un fluoróforo que puede intercambiarse dependiendo de los parámetros del microscopio disponibles. Una vez que se hayan aplicado anticuerpos secundarios fluorescentes, protéjalos de la luz tanto como sea posible. Incubar el anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente, limitando la exposición a la luz. Lavar 3 veces con 1x PBS durante 5 minutos para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios. Para etiquetar los núcleos, use una solución 1:1,000 DAPI/PBS e incube las células durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave 3x con 1x PBS durante 5 minutos en la oscuridad. Para montar, aplique los medios de montaje y deje secar en la oscuridad antes de la obtención de imágenes.NOTA: Los portaobjetos montados se pueden almacenar a temperatura ambiente durante 2-3 días. Para un almacenamiento prolongado, mueva las diapositivas a 4 °C. Imagen dentro de una semana para una señal máxima. Todas las imágenes representativas han sido fotografiadas en un microscopio confocal; sin embargo, también se recomiendan microscopios fluorescentes invertidos.