Qui presentiamo un protocollo per l’isolamento in vitro di più popolazioni di cellule gliali da un SNC di topo. Questo metodo consente la segregazione delle microglia regionali, delle cellule precursori degli oligodendrociti e degli astrociti per studiare i fenotipi di ciascuno in una varietà di sistemi di coltura.
I metodi qui presentati dimostrano procedure di laboratorio per la dissezione di quattro diverse regioni del sistema nervoso centrale (SNC) da neonati murini per l’isolamento di sottopopolazioni gliali. Lo scopo della procedura è quello di dissociare microglia, cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) e astrociti dal tessuto corticale, cerebellare, del tronco cerebrale e del midollo spinale per facilitare ulteriori analisi in vitro. Le procedure di isolamento della regione del SNC consentono di determinare l’eterogeneità regionale tra le glia in più sistemi di coltura cellulare. Viene eseguito un rapido isolamento della regione del SNC, seguito dalla rimozione meccanica delle meningi per prevenire la contaminazione delle cellule meningee della glia. Questo protocollo combina la dissociazione delicata dei tessuti e la placcatura su una matrice specificata progettata per preservare l’integrità e l’aderenza cellulare. L’isolamento della glia mista da più regioni del SNC fornisce un’analisi completa di glia potenzialmente eterogenee, massimizzando al contempo l’uso di singoli animali da esperimento. Inoltre, dopo la dissociazione del tessuto regionale, le glia miste sono ulteriormente suddivise in più tipi di cellule tra cui microglia, OPC e astrociti per l’uso in un singolo tipo di cellula, inserti di piastre di coltura cellulare o sistemi di co-coltura. Nel complesso, le tecniche dimostrate forniscono un protocollo completo di ampia applicabilità per un’attenta dissezione di quattro singole regioni del SNC da neonati murini e includono metodi per l’isolamento di tre singoli tipi di cellule di glia per esaminare l’eterogeneità regionale in qualsiasi numero di sistemi o saggi di coltura cellulare in vitro.
Le glia sono necessarie per una corretta funzione neuronale nel SNC. Sono composti da tre sottopopolazioni principali, astrociti, oligodendrociti e microglia, ognuna con un ruolo diverso, ma indispensabile1. Senza la corretta diversità e attività delle cellule gliali, la funzione neuronale sarebbe gravemente compromessa, portando a compromissione del SNC. Le glia sono in grado di influenzare la neurotrasmissione e ogni tipo di cellula lo fa in modo unico. Le cellule gliali nel cervello hanno la capacità di comunicare tra loro, così come con le cellule neuronali, al fine di facilitare la corretta funzione del SNC2. Gli oligodendrociti aumentano la velocità di trasmissione elettrica attraverso la formazione di una guaina mielinica, che facilita il raggruppamento dei canali ionici ai nodi di Ranvier, i siti di generazione potenziale di azione neuronale3. Le microglia sono fondamentali per la potatura delle sinapsi monitorando la trasmissione sinaptica e “ricablando” le connessioni neuronali dopo la lesione4. Inoltre, le microglia sono la cellula immunitaria residente più abbondante del SNC, agendo come forma primaria di difesa dell’ospite contro i patogeni5. Gli astrociti possono regolare la trasmissione sinaptica tra i neuroni modificando la concentrazione di potassio extracellulare6. Hanno anche ruoli nel controllo del flusso sanguigno locale7, nel rilascio e nell’assorbimento degli elementi neuromodulatori8 e hanno un ruolo chiave nel mantenimento della barriera emato-encefalica9. Pertanto, ogni sottotipo gliale è fondamentale per la funzione del SNC, poiché i difetti di qualsiasi tipo sono stati a lungo associati a un’ampia varietà di stati patologici, tra cui malattie psichiatriche, epilessia e condizioni neurodegenerative10.
Il più grande ostacolo nello studio della patobiologia del SNC è l’incapacità di studiare le cellule umane nel contesto della loro nicchia microambientale. Il tessuto bioptico umano è la maggior parte raccolto post-mortem e le cellule possono essere facilmente danneggiate o perse durante l’estrazione e la lavorazione. Inoltre, è una sfida mantenere le cellule umane vive e vitali in vitro per un certo periodo di tempo senza derivare linee cellulari immortalizzate dai tumori, a quel punto non riflettono più accuratamente le loro normali proprietà fisiologiche11,12. Inoltre, esiste una quantità significativa di eterogeneità regionale tra i singoli tipi di cellule gliali13,14,15 e ottenere campioni regionali del SNC dai singoli pazienti è quasi impossibile. Come tale, è necessario sviluppare modelli alternativi per studiare il contributo della glia regionale in specifici disturbi del SNC.
Qui, descriviamo un sistema in vitro che utilizza l’isolamento specifico della regione del SNC di topo di più sottopopolazioni gliali, consentendo la manipolazione e la quantificazione di microglia, cellule precursori degli oligodendrociti (OPC), che danno origine a oligodendrociti maturi e astrociti. Ogni popolazione può essere isolata in modo indipendente e sottoposta a un’ampia varietà di tecniche sperimentali tra cui il trattamento di farmaci o molecole, immunocitochimica, estrazione e analisi di proteine / RNA e altri sistemi di co-coltura a seconda delle necessità sperimentali. Inoltre, questa tecnica di isolamento produce un elevato numero di cellule, consentendo la caratterizzazione e l’indagine di ciascuna popolazione gliale in modo ad alto rendimento. Consente inoltre lo studio della differenziazione, della crescita e della proliferazione delle cellule del SNC in risposta a un’ampia varietà di stimoli microambientali in modo controllato al fine di evitare fattori confondenti che sono tipicamente presenti in un ambiente in vivo. Infine, questa tecnica di isolamento cellulare facilita la manipolazione delle popolazioni di cellule gliali all’interno di diverse regioni del SNC per studiare come le glia regionali interagiscono tra loro e rispondono a stimoli variabili, consentendo precisione e riproducibilità.
In questo protocollo, descriviamo l’isolamento delle tre principali sottopopolazioni di cellule gliali dal SNC di topo: microglia, OPC e astrociti. Una grave battuta d’arresto per lo studio delle malattie neurodegenerative e neuroinfiammatorie del SNC è la mancanza di cellule e tessuti umani primari, in particolare quelli regionali e dello stesso paziente. Nella maggior parte dei casi, le linee cellulari del SNC umano derivano da cellule tumorali trasformate e immortalizzate che potrebbero non essere rappresentazioni accurate del loro normale comportamento fisiologico20,21,22. Pertanto, sono necessari metodi alternativi per studiare i fenotipi delle cellule del SNC in modo controllato. Inoltre, la diversità delle popolazioni di cellule gliali neurologiche rende necessario studiare ogni sottotipo sia indipendentemente l’uno dall’altro, sia in condizioni di co-coltura al fine di ricapitolare sia le loro funzioni autonome che non autonome cellulare. Le cellule gliali hanno un’ampia varietà di funzioni critiche nel SNC che vanno dal supporto neuronale23, all’apprendimento / cognizione 24,25 e alle risposte immunologiche del SNC26. Come tale, è necessario comprendere le funzioni molecolari e cellulari di ciascuna sottopopolazione gliale in un contesto fisiologico e patologico. Per fare ciò, forniamo qui un metodo affidabile per l’estrazione e l’isolamento di sottotipi di glia vitali. A causa dei vincoli pratici ed etici nella ricerca del soggetto umano, i modelli animali sono attualmente i surrogati più rilevanti per la biologia delle cellule gliali umane. In particolare, i topi sono animali modello ideali in quanto il loro genoma può essere manipolato e analizzato per sezionare ulteriormente particolari meccanismi molecolari alla base della salute e della malattia. Pertanto, la rimozione e la separazione di microglia murina, OPC e astrociti è uno strumento chiave per studiare le funzioni della glia durante condizioni fisiologiche, neurodegenerative o neuroinfiammatorie.
Questo protocollo può essere ottimizzato per esplorare l’eterogeneità regionale delle cellule del SNC. Sta diventando sempre più chiaro che le glia mostrano eterogeneità regionale nella forma e nella funzione. Gli astrociti sono diversi a livello regionale e mostrano morfologia distinta a seconda della loro posizione all’interno del SNC27. Inoltre, la densità degli astrociti e il loro indice mitotico possono definire regioni anatomiche, supportando l’ipotesi che l’eterogeneità degli astrociti regionali possa riflettere differenze molecolari e funzionali basate sulla loro posizione all’interno del SNC28. Anche l’eterogeneità regionale microgliale è oggetto di studio attivo, sebbene i meccanismi sottostanti e le conseguenze funzionali della diversità della microglia nello sviluppo o nel comportamento del SNC non siano attualmente chiari. Tuttavia, è noto che le microglia adulte mostrano diversità nel numero di cellule, nelle strutture cellulari e subcellulari e nelle firme molecolari29. Inoltre, i recenti progressi nella citometria di massa multipla hanno ulteriormente definito l’eterogeneità regionale della microglia, analizzando il fenotipo cellulare da cinque diverse regioni del SNC di nove donatori umani, consentendo l’immunofenotipizzazione su larga scala della microglia umana30. Attualmente, tali approcci sono nelle loro fasi nascenti, rendendo gli studi sugli animali una soluzione praticabile per lo studio della glia regionale nello sviluppo della malattia del SNC. Infine, l’eterogeneità regionale è stata recentemente descritta anche negli oligodendrociti. Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula su 5072 singole cellule provenienti da 10 regioni del SNC giovanile e adulto ha identificato 13 sottopopolazioni distinte in diversi stadi di differenziazione31. È importante sottolineare che è stato anche scoperto che quando gli oligodendrociti maturavano dalle OPC, i loro profili trascrizionali divergevano e i loro fenotipi funzionali cambiavano, evidenziando l’eterogeneità degli oligodendrociti all’interno del SNC31.
Pertanto, la comprensione dell’eterogeneità regionale delle varie cellule residenti del SNC nel contesto dei loro diversi neuroni vicini e di altre glia può fornire un razionale importante per lo sviluppo futuro di nuove terapie per il trattamento di disturbi neuroinfiammatori e neurodegenerativi. Mentre questo protocollo si concentra sull’estrazione, l’isolamento e l’identificazione delle sottopopolazioni gliali, fornisce un comodo punto di partenza per l’esame della loro funzione. Inoltre, può essere adattato e combinato con modelli murini transgenici al fine di studiare i meccanismi genetici associati alla biologia delle cellule gliali. Può anche essere usato per esaminare le risposte delle cellule gliali l’una all’altra in saggi di co-coltura. I passaggi delineati rappresentano un metodo economico e ad alto rendimento per estrarre e isolare diverse popolazioni gliali del SNC che possono quindi essere adattate a un’ampia varietà di parametri sperimentali. Va notato; Tuttavia, che il metodo qui descritto utilizza neonati a causa dei livelli più bassi di mielinizzazione e alta densità di glia proliferante. Per questi motivi, è tecnicamente più fattibile isolare la glia vitale dai neonati rispetto agli animali adulti. Le differenze fenotipiche nella glia neonatale rispetto alla glia adulta dovrebbero quindi essere considerate durante il disegno sperimentale e l’interpretazione dei dati.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Morgan Psenicka per la modifica e la discussione del manoscritto e il Dr. Grahame Kidd per l’assistenza nella formattazione delle figure. Questo lavoro è stato supportato da NIAID K22 AI125466 (JLW).
0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |