Dissection et isolement de la glie murine de plusieurs régions du système nerveux central

REMARQUE : Toutes les études sur les animaux ont été autorisées et approuvées par le Cleveland Clinic Lerner Research Institute Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Préparer les milieux et les fournitures pour la dissection REMARQUE : Toutes les recettes de tampon et de média sont fournies dans le tableau 1. Cette procédure est effectuée dans des conditions stériles dans une culture tissulaire désignée enceinte de biosécurité. Préparer et filtrer stérile les milieux gliaux mélangés (MGM). Cela peut être fait la veille et conservé à 4 °C. Diluer la fibronectine à une concentration de 1:100 avec duH2Ostérile. Le volume de fibronectine diluée dépendra du nombre de petits et de la région du SNC utilisés pour l’expérience. Utilisez une fiole T25 pour 1 cortex, une fiole T25 pour 2-4 cérébelles, une fiole T25 pour 2-4 troncs cérébraux et une fiole T25 pour 2-4 moelle épinière.REMARQUE: La combinaison de tissus de la même région en utilisant les critères énumérés ci-dessus permettra une dissociation adéquate sans modifier le protocole décrit ci-dessous. La combinaison d’un plus grand nombre de tissus que celui décrit à l’étape 1.2 nécessitera une optimisation supplémentaire des concentrations de réactifs de dissociation. Pipeter 3 mL de fibronectine diluée dans des flacons T25 à température ambiante et laisser reposer pendant 2 min. Aspirer la fibronectine et laisser sécher les flacons pendant la nuit avec le couvercle de la fiole desserré. 2. Curage du cortex, du cervelet, du tronc cérébral et de la moelle épinière REMARQUE : Cette procédure peut être effectuée sur la paillasse et nécessite une portée de dissection. Utilisez une technique d’asepsie stricte pour toutes les étapes de la procédure et minimisez l’exposition des tissus à l’air ambiant. Gardez tous les milieux réfrigérés sur la glace pendant la dissection pour assurer une préservation maximale des tissus. Alternativement, cette procédure pourrait être effectuée dans un capot qui permet l’utilisation d’une lunette de dissection interne. Essuyez toutes les zones avec de l’éthanol à 70%. Pipeter 10 ml de PBS/solution antibiotique (PAS) dans une boîte de Pétri de 10 cm. Préparez une boîte de Petri pour chaque chiot à disséquer. Mettez sur la glace pour garder la solution au frais. Dans une hotte de culture tissulaire désinfectée, pipeter 9 mL de DMEM (sans additifs) dans 4 tubes coniques distincts de 15 mL, un pour chaque région du SNC, remplacer les bouchons de tube et mettre sur de la glace. Placez le seau à glace avec des tubes à portée de main de la lunette de dissection. Placer la boîte de Petri de 10 cm préparée à l’étape 2.2 au stade de la lunette de dissection désinfectée. Anesthésier et euthanasier le chiot de souris selon le protocole institutionnel et enlever la tête par décapitation rapide avec des ciseaux tranchants.NOTE: Jour postnatal (P) 3-5 petits sont utilisés. Les chiots plus âgés ont un SNC plus développé et peuvent ne pas être une source adéquate de cellules gliales en expansion. Les chiots plus jeunes (P) 0-2 peuvent produire un plus grand nombre de glies et peuvent être utilisés; Cependant, le tissu de la moelle épinière est très difficile à disséquer à ce jeune âge en raison de sa taille. Nettoyez la peau du chiot avec de l’éthanol à 70%. À l’aide de fins ciseaux, couper la couche cutanée le long de la ligne médiane de la tête de l’animal, en commençant caudale et en se déplaçant rostral, jusqu’à atteindre le museau. Évitez de couper profondément dans le crâne pour éviter toute lésion tissulaire. En inclinant la tête vers le bas, tirez la couche cutanée de chaque côté du crâne et, à l’aide de ciseaux à ressort, faites une incision le long de la ligne médiane du crâne, en commençant par le foramen magnum, en coupant à nouveau la caudale au rostral. À l’aide d’une pince à pointe fine, tirez les moitiés du crâne vers les côtés droit et gauche, exposant le cortex, le cervelet et le tronc cérébral. Une fois exposé, soulevez doucement le cerveau hors du crâne et dans la boîte de Petri de 10 cm préparée à l’étape 2.2. Assurez-vous que le cerveau reste intact pour préserver la structure anatomique, avec le cerveau postérieur attaché. À l’aide de pinces fines à pointe incurvée avec la pointe de la pince tournée vers le haut, pincez le cervelet. Retirer les méninges et les placer dans un tube conique désigné de 15 ml dans un seau à glace. Assurez-vous que le tronc cérébral est directement ventral au cervelet et qu’il est visible après l’ablation du cervelet. Retirez-le à l’aide d’une pince à pointe fine, retirez les méninges et placez-le dans un tube conique désigné de 15 ml dans un seau à glace. Séparez le mésencéphale du cortex, retirez les méninges corticales et placez-les dans un tube conique désigné de 15 ml dans un seau à glace. Pour retirer la moelle épinière, placez le chiot souris décapité en décubitus dorsal (couché face vers le haut) avec la colonne vertébrale sectionnée élevée vers l’investigateur. Pulvériser à nouveau avec de l’éthanol à 70%. Couper le long des côtés latéraux de la colonne vertébrale, dans une direction rostrale à caudale, à travers la cage thoracique jusqu’à atteindre les membres postérieurs. Pendant la coupe, repoussez les organes internes jusqu’à ce que la colonne vertébrale soit visible. Couper le long de chaque côté latéral de la colonne vertébrale jusqu’à ce qu’elle soit isolée et placer dans la boîte de Petri de 10 cm préparée à l’étape 2.2. Avec le côté ventral vers le haut, à l’aide de fins ciseaux à ressort, couper alternativement les côtés droit et gauche de chaque vertèbre jusqu’à atteindre la région lombaire pour exposer le tissu de la moelle épinière. Retirez délicatement la moelle épinière et les méninges à l’aide d’une pince à pointe fine au microscope à dissection. Placer dans un tube conique désigné de 15 ml dans un seau à glace. Répéter les étapes 2.5.-2.19 pour chaque chiot, en combinant les tissus de la même région pour répondre aux critères énoncés à l’étape 1.2 pour chaque fiole T25 préparée.REMARQUE: Retirez les méninges aussi complètement que possible. S’il reste une quantité importante de méninges, le phénotype de fibroblaste des cellules méningées dépassera et submergera la culture cellulaire. Plusieurs moelles épinières, de phénotype égal, peuvent être combinées afin de générer une culture cellulaire spécifique. Prenez soin de vous assurer que l’encombrement des cellules ne se produit pas, ce qui peut entraîner une apoptose gliale et des phénotypes différentiels. 3. Dissociation tissulaire NOTE: Toutes les procédures suivantes sont effectuées dans une culture de tissus stérile désignée enceinte de biosécurité en utilisant une technique aseptique et des matériaux stériles. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,05 % contenant 0,53 mM d’EDTA à chaque tube conique de 15 mL de DMEM à 9 mL et au tissu pour commencer la lyse tissulaire.REMARQUE: DMEM contient une grande quantité de chlorure de calcium, qui peut agir comme un inhibiteur de la trypsine. Si la dissociation n’est pas complète en suivant les étapes décrites, la solution saline équilibrée de Hanks sans calcium ni magnésium peut être utilisée. Après trypsinisation, l’enzyme peut être neutralisée en ajoutant un inhibiteur de trypsine, bien que le calcium doive être ajouté à la solution car il s’agit d’un cofacteur de la DNase I, qui est utilisée dans les étapes suivantes. Triturate avec une pipette de 10 ml environ 20x. Transférer les suspensions cellulaires dans des tubes coniques vides de 50 mL. Incuber la solution à 37 °C, 5% de CO2 pendant 15 min, en agitant doucement les lysats après 8 min. Ajouter 5 mL de MGM et 200 μL (5 mg/mL) de DNase I à chaque tube pour obtenir une concentration finale de 50 μg/mL. Triturer chaque lysat avec une pipette 10x de 10 mL. Laisser reposer les suspensions cellulaires pendant 3 min à température ambiante pour permettre aux tissus non dissociés de se déposer au fond des tubes. Transférer les suspensions cellulaires dans de nouveaux tubes coniques de 50 mL, en laissant derrière eux le tissu non dissocié.REMARQUE : Les étapes de lyse et de trituration décrites ci-dessus limitent considérablement la quantité de tissu non dissocié. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 3 min à 4 °C sans frein. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires restantes dans 5 mL de MGM. Triturer la pastille avec une pipette de 5 mL 20x. Plaquer les suspensions cellulaires de 5 mL sur des fioles T25 revêtues. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO2 et changer de milieu initialement après 24 h pour éliminer les débris cellulaires.REMARQUE: Certains protocoles recommandent un changement de support initial après 72 heures. L’optimisation de cette étape peut être nécessaire. Effectuez un changement de milieu à 100 % avec MGM toutes les 48 à 72 heures jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 80 % (environ 5 à 7 jours).REMARQUE : Tous les supports doivent être chauffés à 37 °C avant de changer de support. 4. Isolement de la microglie Une fois que les cultures gliales mixtes ont atteint 80% de confluence, préparez les flacons pour les agiter en serrant les couvercles et en les scellant avec un film de paraffine. Pour éliminer les microglies des cultures gliales mixtes, fixer les flacons horizontalement sur un agitateur orbital à l’intérieur d’un incubateur à 37 °C. Agiter les flacons à 15 x g pendant 1 h. Retirer le média et la pipette dans un tube conique de 15 mL. Rincer les flacons deux fois avec 3 ml de MGM tiède, en ajoutant du lavage aux tubes coniques de 15 ml. Ce sont les microglies. Ajouter 5 ml de MGM chaud et frais dans les flacons de culture. Refermer les fioles avec un film de paraffine, fixer les fioles horizontalement sur agitateur et agiter à 15 x g à 37 °C pendant 15 h pour séparer les OPC des astrocytes.REMARQUE: Cette étape peut être effectuée pendant la nuit, mais le temps de secouage de 15 heures est critique car un temps supplémentaire peut entraîner la mort cellulaire. Centrifuger le surnageant de l’étape 4.3. à 300 x g pendant 3 min et culture microgliale selon les protocoles standard16 ou utilisation pour un essai biologique. 5. Isolement cellulaire précurseur des oligodendrocytes REMARQUE : Lors du placage des OPC après l’isolement initial, ils doivent être plaqués sur une surface revêtue de poly-D-lysine (plaque stérile ou couvercle). Préparez ces documents avant de remplir cette section. Après 15 heures de agitation, retirer le surnageant des flacons et de la plaque sur une boîte de Petri stérile de 100 mm. Incuber le surnageant à 37 °C, 5% de CO2 pendant 30 min, en remuant après 15 min pour éliminer les microglies restantes, car celles-ci adhéreront très rapidement à la boîte. Des boîtes de Petri non traitées par culture tissulaire peuvent être utilisées pour cette étape. Retirez le surnageant cellulaire non adhérent, le nombre et la plaque sur une surface recouverte de poly-D-lysine. En règle générale, 7 500 à 10 000 OPC sont plaqués/cm2. Incuber à 37 °C, 5% de CO2 pendant au moins 1 h (jusqu’à 6 h), puis aspirer doucement 95% des milieux et ajouter lentement des milieux OPC chauds, en pipetant le média contre la paroi du puits pour minimiser la perturbation des OPC. Changez de support toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à l’emploi.REMARQUE : Il est essentiel qu’un seul puits soit changé à la fois. Les OPC sont sensibles et sont particulièrement intolérants aux conditions sèches. L’ajout de PDGF-AA dans les milieux OPC retarde la maturation de l’OPC en oligodendrocytes. Ce facteur peut être exclu des milieux de culture si l’objectif expérimental est mis sur les oligodendrocytes matures. 6. Isolement des astrocytes Après 15 h de agitation, retirer le surnageant et rincer les flacons 2x avec 1x PBS chaud. Ajouter 4 mL de trypsine à 0,05 % contenant 0,53 mM d’EDTA et incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 5 minutes ou jusqu’à ce que les cellules se soient soulevées. Pour vous assurer que les astrocytes se sont soulevés, visualisez-les à l’aide d’un microscope à grand champ standard. Les astrocytes apparaîtront sphériques après trypsinisation. Une fois que les astrocytes se sont détachés, placer la fiole verticalement et ajouter 4 mL de MGM. Triturate à mélanger. Pipeter les astrocytes dans un tube conique de 15 mL, centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Resuspendre les astrocytes dans les milieux astrocytaires et les plaquer sur une surface recouverte de fibronectine, comme décrit à l’étape 1.2. ou utiliser pour des essais biologiques.REMARQUE: Un facteur de croissance de fibroblastes murins de 20 ng / mL peut être ajouté lors du premier changement de milieu pour aider à établir la culture des astrocytes. De plus, l’enrobage de gélatine standard peut être une alternative peu coûteuse à la fibronectine. 7. Identification et isolement de la microglie, des OPC, des astrocytes et des oligodendrocytes matures par immunocytochimie Une fois que les cellules plaquées ont atteint la confluence appropriée, retirer doucement le milieu et fixer les cellules adhérentes en utilisant 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 minutes. Faites cette étape dans une armoire de biosécurité.REMARQUE: Lors de l’aspiration ou de l’ajout de solutions, pipette avec une légère pression pour éviter le décollement de la cellule. Aspirer lentement le PFA puis laver les cellules 3x avec 1x PBS pendant 5 min. Préparer une solution bloquante appropriée en utilisant 10% de sérum et 0,1% de Triton X-100 dans 1x PBS.REMARQUE : La source sérique reflète l’animal hôte chez lequel l’anticorps secondaire a été élevé. Par exemple, si l’anticorps secondaire est anti-lapin de chèvre, le sérum bloquant approprié est le sérum de chèvre normal. De même, si l’anticorps secondaire est anti-lapin d’âne, le sérum bloquant doit être du sérum d’âne normal. Ajouter la solution de blocage jusqu’à ce que les cellules soient complètement recouvertes. Bloquer pendant 1 h à température ambiante. Préparer une solution de diluant d’anticorps (9 mL de 1x PBS, 0,01 g d’albumine sérique bovine, 30 μL de Triton X-100). Alternativement, les anticorps peuvent être dilués dans la solution de blocage décrite à l’étape 6.3. Diluer les anticorps primaires spécifiques des éléments suivants dans un diluant d’anticorps ou une solution bloquante:Microglie : molécule ionisée d’adaptateur de liaison au calcium 1 (Iba1) à une dilution de 1:250 (2,4 μg/mL). OPC : antigène neural/glial 2 (NG2) à une dilution de 1:200 (5 μg/mL). Oligodendrocytes matures : protéine basique de myéline (MBP) à une dilution de 1:400 (la concentration dépend du lot et une optimisation peut être nécessaire). Astrocytes : protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) à une dilution de 1:400 (0,25 μg/mL)17.REMARQUE : Ne mélangez pas les anticorps primaires élevés chez la même espèce.REMARQUE: GFAP marquera de manière fiable les astrocytes de substance blanche. Pour les astrocytes de matière grise, un autre marqueur peut devoir être utilisé. Incuber l’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C (avec une agitation douce est préférable). Lavez 3x avec 1x PBS pendant 5 min pour éliminer l’anticorps primaire. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires appropriés à une dilution de 1:400 dans un diluant d’anticorps ou une solution de blocage protégée de la lumière.REMARQUE : Les anticorps secondaires sont conjugués à un fluorophore qui peut être interchangé en fonction des paramètres disponibles au microscope. Une fois que les anticorps secondaires fluorescents ont été appliqués, protéger de la lumière autant que possible. Incuber l’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante, en limitant l’exposition à la lumière. Lavez 3 fois avec 1x PBS pendant 5 minutes pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires. Pour marquer les noyaux, utilisez une solution DAPI/PBS 1:1 000 et incuber les cellules pendant 5 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Lavez 3x avec 1x PBS pendant 5 min dans l’obscurité. Pour monter, appliquez le support de montage et laissez sécher dans l’obscurité avant l’imagerie.REMARQUE: Les lames montées peuvent être stockées à température ambiante pendant 2-3 jours. Pour un stockage à long terme, déplacez les lames à 4 °C. Image dans un délai d’une semaine pour un signal maximal. Toutes les images représentatives ont été imagées au microscope confocal; Cependant, les microscopes fluorescents inversés sont également recommandés.