Medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous

Interações sinápticas facilitadas por moléculas de adesão sináptica são fundamentais para o desenvolvimento, organização, especificação, manutenção e função das sinapses e da geração de redes neurais. A identificação dessas moléculas de adesão celular transsináptica está aumentando rapidamente; assim, é fundamentalmente importante identificar parceiros vinculantes e entender como essas novas moléculas de adesão interagem entre si. Além disso, o sequenciamento do genoma identificou mutações em muitas dessas moléculas de adesão que estão comumente ligadas a uma infinidade de distúrbios neurodesenvolvimentos, neuropsiquiátricos e de dependência¹. Mutações em genes que codificam moléculas de adesão celular sináptica podem alterar prejudicialmente interações trans e podem contribuir para alterações fiofoficológicas na formação e ou manutenção da sinapse.

Existem ensaios múltiplos para avaliar quantitativamente interações proteína-proteína, como calrómetria isotérmica, dicromaísmo circular, ressonância de plasmon superficial² e, embora quantitativa na natureza, eles têm várias limitações. Primeiro, eles requerem proteína recombinante, às vezes exigindo passos longos e tediosos de purificação. Em segundo lugar, exigem equipamentos especializados sofisticados e conhecimentos técnicos. Em terceiro lugar, eles podem superestimar a extensão da ligação, pois permitem interações cis e trans entre proteínas que são naturalmente amarradas a uma membrana in vivo. Aqui propomos um ensaio simples e relativamente rápido que testa exclusivamente interações trans.

Para contornar muitas das complicações associadas a ensaios proteicos purificados, otimizamos um ensaio de interação proteica baseado em células que recapitula interações trans em um sistema celular heterologos reduzido. Este ensaio tem sido usado anteriormente de várias formas para estudar interações transcelulares. Nesta abordagem, moléculas de adesão celular candidatas são transfectadas em células HEK293T. Em condições fisiológicas, as células HEK293T não apresentam auto-agregação, tornando-as modelos exemplares para este ensaio. No entanto, quando populações individuais de células HEK expressando receptor e ligante são combinadas, a ligação do receptor e do ligante força a agregação de células HEK a ocorrer. Esta agregação é mediada exclusivamente por interações trans e geralmente é observável em dezenas de minutos. Não são necessárias etapas de purificação de proteínas neste método, e a eficiência do método baseia-se no paradigma de que populações de células HEK expressando moléculas de adesão cogna estão sendo combinadas e, em seguida, imagens apenas dezenas de minutos depois. Além disso, este método é relativamente barato, pois nem anticorpos nem equipamentos caros são necessários. O único equipamento necessário para a aquisição de dados é um microscópio fluorescente padrão. Uma vantagem adicional para este ensaio baseado em células é a capacidade de rastrear rapidamente o efeito de mutações de pontos relevantes da doença nas interações trans. Isso pode ser realizado transfecando células HEK com cDNAs das variantes mutantes da proteína de interesse.

Neste protocolo, apresentamos um exemplo no qual investigamos se uma mutação missense em Neurexin3α (Neurexin3α^A687T), identificada em um paciente diagnosticado com profunda deficiência intelectual e epilepsia, altera interações em trans com proteína trans trans reito transmembrana 2 (LRRTM2). Neurexin3α é um membro da família evolutivamente conservada de moléculas de adesão celular pré-sináptica e, embora o trabalho recente tenha identificado múltiplos papéis na sinapse^3,4,5,6,7, nossa compreensão sináptica desta molécula e todos os membros da família neurexina permanecem incompletos. LRRTM2 é uma proteína de adesão celular pós-sináptica excitatória que participa da formação e manutenção da sinapse^8,9,10. É importante ressaltar que o LRRTM2 interage exclusivamente com isoformas de neurexina que não possuem o local da emenda 4 exon alternativo (SS4-), mas não com isoformes de neurexina contendo o local da emenda 4 exon alternativo (SS4+). A mutação missense humana (A687T) identificada em Neurexin3α está localizada em uma região extracelular não estudada que é evolutivamente conservada e é conservada entre todas as neurexinas alfa⁷. Como a interação entre essas duas moléculas foi estabelecida^8,9,11, colocamos a questão: a capacidade de ligação de Neurexin3α SS4- para LRRTM2 é alterada por uma mutação de ponto A687T? Este ensaio revelou que a mutação de ponto A687T aumentou inesperadamente a agregação de Neurexin3α para LRRTM2 sugerindo que a região extracelular em que a mutação de ponto está localizada, desempenha um papel na mediação de interações transsinápticas.