Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Eiwitinteracties op cellulaire interfaces dicteren een veelheid aan biologische uitkomsten, variërend van weefselontwikkeling en kankerprogressie tot synapsvorming en -onderhoud. Veel van deze fundamentele interacties komen voor in trans en worden meestal veroorzaakt door heterofiele of homofiele interacties tussen cellen die membraanverankerde bindingsparen uitdrukken. Het ophelderen hoe ziekterelevante mutaties deze fundamentele eiwitinteracties verstoren, kan inzicht geven in een groot aantal celbiologievelden. Veel eiwit-eiwit interactietests zijn meestal niet disambiguate tussen cis en trans interacties, wat mogelijk leidt tot een overschatting van de mate van binding die optreedt in vivo en omvat arbeidsintensieve zuivering van eiwitten en / of gespecialiseerde bewakingsapparatuur. Hier presenteren we een geoptimaliseerd eenvoudig protocol dat het mogelijk maakt om alleen transinteracties te observeren en te kwantificeren zonder dat langdurige eiwitzuiveringen of gespecialiseerde apparatuur nodig zijn. De HEK-celaggregatietest omvat het mengen van twee onafhankelijke populaties HEK-cellen, die elk membraangebonden cognate liganden uitdrukken. Na een korte incubatieperiode worden monsters in beeld genomen en worden de resulterende aggregaten gekwantificeerd.
Synaptische interacties gefaciliteerd door synaptische adhesiemoleculen zijn fundamenteel voor de ontwikkeling, organisatie, specificatie, onderhoud en functie van synapsen en de generatie van neurale netwerken. De identificatie van deze transsynaptische celhechtingsmoleculen neemt snel toe; het is dus van fundamenteel belang om bindende partners te identificeren en te begrijpen hoe deze nieuwe hechtingsmoleculen met elkaar interageren. Bovendien heeft genoomsequentie mutaties geïdentificeerd in veel van deze hechtingsmoleculen die vaak verband houden met een veelheid aan neuroontwikkelings-, neuropsychiatrische en verslavingsstoornissen1. Mutaties in genen die coderen voor synaptische celhechtingsmoleculen kunnen transinteracties nadelig veranderen en kunnen bijdragen aan patofysiologische veranderingen in synapsvorming en of onderhoud.
Er bestaan meerdere tests om eiwit-eiwitinteracties kwantitatief te beoordelen, zoals isothermische calorimetrie, circulair dichroïsme, oppervlakteplasmonresonantie2 en hoewel kwantitatief van aard, hebben ze verschillende beperkingen. Ten eerste hebben ze recombinant eiwit nodig, wat soms lange en vervelende zuiveringsstappen vereist. Ten tweede hebben ze geavanceerde gespecialiseerde apparatuur en technische expertise nodig. Ten derde kunnen ze de mate van binding overschatten, omdat ze zowel cis- als transinteracties mogelijk maken tussen eiwitten die van nature aan een membraan in vivo zijn vastgebonden. Hier stellen we een eenvoudige en relatief snelle test voor die uitsluitend transinteracties test.
Om veel van de complicaties in verband met gezuiverde eiwittests te omzeilen, hebben we een op cellen gebaseerde eiwitinteractietest geoptimaliseerd die transinteracties in een verminderd heterologe celsysteem herkapitaliseert. Deze test is eerder in verschillende vormen gebruikt om transcellulaire interacties te bestuderen. In deze benadering worden kandidaatcelhechtingsmoleculen omgezet in HEK293T-cellen. Bij fysiologische omstandigheden vertonen HEK293T-cellen geen zelfaggregatie, waardoor ze voorbeeldige modellen zijn voor deze test. Echter, wanneer individuele populaties van HEK-cellen die receptor en ligand uitdrukken worden gecombineerd, de binding van de receptor en de ligand krachten aggregatie van HEK cellen optreden. Deze aggregatie wordt uitsluitend bemiddeld door transinteracties en is meestal in tientallen minuten waarneembaar. Er zijn geen eiwitzuiveringsstappen vereist in deze methode, en de efficiëntie van de methode is gebaseerd op het paradigma dat populaties hek-cellen die cognate adhesiemoleculen uitdrukken, worden gecombineerd en vervolgens slechts tientallen minuten later in beeld worden gebracht. Bovendien is deze methode relatief goedkoop, omdat er geen antilichamen of dure apparatuur nodig zijn. De enige apparatuur die nodig is voor het verkrijgen van gegevens is een standaard fluorescerende microscoop. Een bijkomend voordeel van deze celgebaseerde test is het vermogen om het effect van ziekterelevante puntmutaties op transinteracties snel te screenen. Dit kan worden uitgevoerd door HEK-cellen te transfecteren met cDCA’s van de mutante varianten van het eiwit van belang.
In dit protocol presenteren we een voorbeeld waarin we onderzoeken of een missense mutatie in Neurexin3α (Neurexin3αA687T),geïdentificeerd bij een patiënt gediagnosticeerd met een ernstige verstandelijke beperking en epilepsie, interacties in trans verandert met leucine-rijke herhaalde transmembrane eiwit 2 (LRRTM2). Neurexin3α is een lid van de evolutionair geconserveerde familie van presynaptische celhechtingsmoleculen en hoewel recent werk meerdere rollen heeft geïdentificeerd bij de synaps3,4,5,6,7, blijft ons synaptische begrip van dit molecuul en alle leden van de neurexinefamilie onvolledig. LRRTM2 is een excitatory postsynaptische celhechtingseiwit dat deelneemt aan synapsvorming en -onderhoud8,9,10. Belangrijk is dat LRRTM2 uitsluitend interageert met neurexine isovormen die de splice site 4 alternatieve exon (SS4-) missen, maar niet met neurexine isoformen die de splice site 4 alternatieve exon (SS4+) bevatten. De menselijke missense mutatie (A687T) geïdentificeerd in Neurexin3α bevindt zich in een niet-bestudeerd extracellulair gebied dat evolutionair geconserveerd is en wordt bewaard tussen alle alfaneurexinen7. Aangezien de interactie tussen deze tweemoleculenis vastgesteld 8,9,11, stelden we de vraag: is het bindingsvermogen van Neurexin3α SS4- naar LRRTM2 gewijzigd door een A687T-puntmutatie? Deze test onthulde dat de A687T-puntmutatie onverwacht de aggregatie van Neurexin3α naar LRRTM2 verbeterde, wat suggereert dat het extracellulaire gebied waarin de puntmutatie zich bevindt, een rol speelt bij het bemiddelen van transsynaptische interacties.
Het ontleden van de eiwit-eiwitinteracties die optreden in trans tijdens celhechting kan leiden tot een beter begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan basis cellulaire processen, waaronder de vorming, functie en onderhoud van synapsen tijdens rijping en remodellering. De implicaties van cel-celinteracties breiden zich verder uit dan neurobiologie en hebben een bredere rol in signaaltransductie, celmigratie en weefselontwikkeling14. Aberraties in celhechting kunnen cellula…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door grants van het National Institute of Mental Health (R00MH103531 en R01MH116901 aan J.A.), een predoctorale training Grant van het National Institute of General Medicine (T32GM007635 to S.R.), en een Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 to S.R.). We danken Dr. Kevin Woolfrey voor hulp met de microscoop, Dr. K Ulrich Bayer voor het gebruik van zijn epifluorescente microscoop, en Thomas Südhof (Stanford University) voor de LRRTM2 plasmide.
1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
HEK293T cells | ATCC | Model system | |
ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |