Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias

El sistema nervioso central (SNC) es un sitio inmunológicamente especializado. El parénquima del SNC, excluyendo el espacio LCR, las meninges y la vasculatura, es considerado clásicamente como un sitio inmunoprivilegiado 1,2,3,4,5 y está relativamente desprovisto de células inmunitarias durante las condiciones homeostáticas ^2,6,7. Por el contrario, las meninges, compuestas por las capas duramadre, aracnoidea y pia, son componentes cruciales del compartimento del SNC, participando activamente en la vigilancia inmunitaria homeostática y en los procesos inflamatorios durante la patogénesis de la enfermedad 3,6,7,8. Durante las condiciones de estado estacionario, las meninges albergan numerosas células centinela inmunitarias, incluidas las células linfoides innatas (ILC), los macrófagos, las células dendríticas (DC), los mastocitos, las células T y, en menor medida, las células B 9,10,11.

Las meninges son estructuras altamente vascularizadas y contienen vasos linfáticos que proporcionan una conexión linfática entre el SNC y su periferia 8,12,13,14. En las afecciones inflamatorias inducidas por lesiones del SNC, infecciones, autoinmunidad o incluso neurodegeneración, las células inmunitarias de origen periférico se infiltran en el parénquima y alteran el paisaje inmunitario dentro de las meninges. Después de la infiltración celular, las meninges pueden representar un nicho funcional para las células inmunitarias derivadas periféricamente, promoviendo la agregación de células inmunitarias, la activación local de las células inmunitarias y la supervivencia a largo plazo en el compartimento del SNC. La inflamación meníngea prominente se observa en múltiples enfermedades que afectan al SNC, incluyendo la esclerosis múltiple (EM)15,16,17,18,19, el accidente cerebrovascular 20,21, la lesión estéril 22,23 (es decir, la lesión de la médula espinal y la lesión cerebral traumática), las migrañas 24 y la infección microbiana ^25,26,^27,28,29. Por lo tanto, la caracterización de las células residentes y las células inmunitarias derivadas periféricamente en el compartimento meníngeo es esencial para comprender el papel de estas células durante las condiciones de estado estacionario y la patogénesis de la enfermedad.

La extracción del cerebro, la médula espinal y las meninges del cráneo y los cuerpos vertebrales es técnicamente difícil y requiere mucho tiempo. Actualmente no existen técnicas disponibles para la extracción rápida del cerebro con las tres capas meníngeas intactas. Si bien la laminectomía produce una excelente morfología del tejido de la médula espinal y preserva las capas meníngeas, requiere mucho tiempo y es extremadamente complicada^30,31. Por el contrario, los métodos de extracción más convencionales, como la extirpación del cerebro del cráneo y la extrusión hidráulica de la médula espinal, facilitan la extracción rápida del tejido del SNC, pero con estas técnicas se pierden tanto las meninges aracnoideas como las durales^30,31. La omisión de las capas duramadre y aracnoidea durante el aislamiento convencional de los tejidos del cerebro y la médula espinal da lugar a un análisis incompleto de las células dentro del compartimento del SNC. Por lo tanto, la identificación de nuevas técnicas enfocadas a la extracción rápida de tejidos del SNC con meninges intactas es crucial para el análisis óptimo del compartimento del SNC.

Este manuscrito presenta dos métodos para la extracción rápida del cerebro, la médula espinal y las meninges de ratones, lo que facilita el análisis posterior de las células residentes y las células inmunitarias derivadas periféricamente en el parénquima y las meninges del SNC. Estos protocolos optimizados se centran en 1) aislar suspensiones unicelulares para el análisis posterior y 2) preparar el tejido para el procesamiento histológico. La obtención de suspensiones unicelulares del cerebro, del tejido de la médula espinal y de las meninges durales y aracnoideas³² permite el análisis simultáneo de las células que residen en los compartimentos parenquimatoso y meníngeo. Las suspensiones unicelulares se pueden utilizar en diferentes aplicaciones, incluidos los ensayos de cultivo celular para realizar estimulación in vitro 33, inmunopunto ligado a enzimas (ELISpot)28,34,35, citometría de flujo^36,33 y transcriptómica de una sola célula ³⁷ o a granel. Además, el protocolo optimizado para la descalcificación de cerebros enteros y médula espinal con cráneos o columnas vertebrales intactos, respectivamente, permite la descalcificación suave del hueso circundante, dejando las meninges intactas y preservando la morfología del tejido. Este método permite la identificación selectiva de proteínas o ARN mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) o hibridación in situ (ISH) tanto en el espacio parenquimatoso como en el meníngeo. La caracterización del fenotipo, el estado de activación y la localización de las células residentes y las células inmunitarias derivadas periféricamente dentro del SNC puede proporcionar información esencial para comprender cómo los tipos de células individuales en el compartimento del SNC contribuyen a la homeostasis y la patogénesis de la enfermedad.