Isoleren van weefsels van het centrale zenuwstelsel en bijbehorende hersenvliezen voor de downstream-analyse van immuuncellen

Het centrale zenuwstelsel (CZS) is een immunologisch gespecialiseerde plaats. Het CZS-parenchym, met uitzondering van de CSF-ruimte, de hersenvliezen en de vasculatuur, wordt klassiek gezien als een immuunbevoorrechte plaats 1,2,3,4,5 en is relatief verstoken van immuuncellen tijdens homeostatische omstandigheden ^2,6,7. Daarentegen zijn de hersenvliezen, bestaande uit de dura-, arachnoïde- en pialagen, cruciale componenten van het CZS-compartiment, die actief deelnemen aan homeostatische immuunsurveillance en ontstekingsprocessen tijdens ziektepathogenese 3,6,7,8. Tijdens steady state-omstandigheden ondersteunen de hersenvliezen talrijke immuunschildwachtcellen, waaronder aangeboren lymfoïde cellen (ILC), macrofagen, dendritische cellen (DC), mestcellen, T-cellen en in mindere mate B-cellen 9,10,11.

De hersenvliezen zijn sterk gevasculariseerde structuren en bevatten lymfevaten die zorgen voor een lymfatische verbinding tussen het CZS en de periferie 8,12,13,14. Bij ontstekingsaandoeningen veroorzaakt door CZS-letsel, infecties, auto-immuniteit of zelfs neurodegeneratie, infiltreren perifeer afgeleide immuuncellen het parenchym en veranderen het immuunlandschap in de hersenvliezen. Na celinfiltratie kunnen de hersenvliezen een functionele niche vormen voor perifeer afgeleide immuuncellen, waardoor immuuncelaggregatie, lokale immuuncelactivering en overleving op lange termijn in het CZS-compartiment worden bevorderd. Prominente meningeale ontsteking wordt waargenomen bij meerdere ziekten die het CZS beïnvloeden, waaronder multiple sclerose (MS) 15,16,17,18,19, beroerte 20,21, steriel letsel 22,23 (d.w.z. ruggenmergletsel en traumatisch hersenletsel), migraine 24 en microbiële infectie ^25,26,^27,28,29. De karakterisering van residente cellen en perifeer afgeleide immuuncellen in het meningeale compartiment is dus essentieel voor het begrijpen van de rol van deze cellen tijdens steady state-omstandigheden en ziektepathogenese.

De extractie van de hersenen, het ruggenmerg en de hersenvliezen uit de schedel en wervellichamen is technisch uitdagend en tijdrovend. Er zijn momenteel geen technieken beschikbaar voor de snelle extractie van de hersenen met alle drie de meningeale lagen intact. Hoewel laminectomie een uitstekende morfologie van het ruggenmergweefsel oplevert en de meningeale lagen behoudt, is het zowel extreem tijdrovend als gecompliceerd^30,31. Omgekeerd vergemakkelijken meer conventionele extractiemethoden zoals de verwijdering van de hersenen uit de schedel en de hydraulische extrusie van het ruggenmerg de snelle extractie van het CZS-weefsel, maar zowel de arachnoïdale als durale hersenvliezen gaan verloren met deze technieken^30,31. Het weglaten van dura- en arachnoïdelagen tijdens conventionele isolatie van hersen- en ruggenmergweefsels resulteert in een onvolledige analyse van de cellen in het CZS-compartiment. De identificatie van nieuwe technieken gericht op de snelle extractie van CZS-weefsels met intacte hersenvliezen is dus cruciaal voor de optimale analyse van het CZS-compartiment.

Dit manuscript presenteert twee methoden voor de snelle extractie van de hersenen, het ruggenmerg en de hersenvliezen van muizen, waardoor de stroomafwaartse analyse van residente cellen en perifeer afgeleide immuuncellen in het CZS-parenchym en hersenvliezen wordt vergemakkelijkt. Deze geoptimaliseerde protocollen richten zich op 1) het isoleren van eencellige suspensies voor downstream-analyse en 2) het voorbereiden van weefsel voor histologische verwerking. Het verkrijgen van eencellige suspensies uit de hersenen, ruggenmergweefsel en durale en arachnoïdale^{hersenvliezen 32} maakt de gelijktijdige analyse mogelijk van cellen die zich in zowel het parenchymale als het meningeale compartiment bevinden. Eencellige suspensies kunnen worden gebruikt in verschillende toepassingen, waaronder celkweektests om in vitro stimulatie 33 uit te voeren, enzyme-linked immunospot (ELISpot) 28,34,35, flowcytometrie ^36,33 en single-cell ³⁷ of bulk transcriptomics. Bovendien zorgt het geoptimaliseerde protocol voor ontkalking van hele hersenen en ruggenmerg met intacte schedels of wervelkolommen respectievelijk voor de zachte ontkalking van het omliggende bot, waardoor de hersenvliezen intact blijven en de weefselmorfologie behouden blijft. Deze methode maakt de selectieve identificatie van eiwitten of RNA mogelijk met behulp van immunohistochemie (IHC) of in situ hybridisatie (ISH) technieken binnen zowel de parenchymale als meningeale ruimten. De karakterisering van het fenotype, de activeringstoestand en de lokalisatie van residente cellen en perifeer afgeleide immuuncellen in het CZS kan informatie opleveren die essentieel is om te begrijpen hoe individuele celtypen in het CZS-compartiment bijdragen aan homeostase en ziektepathogenese.