초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

모든 연구 및 동물 관리 절차는 베일러 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었으며 베일러 의과 대학의 실험실 동물 관리 승인 동물 시설의 평가 및 인증 협회에 보관되었습니다. 모든 균주는 C57BL6 배경에서 유지되었습니다. 1. 배아 해부 (E7.5-E9.5) 임신 한 여성 마우스에서 자궁 뿔을 제거하고 절개가 만들어질 70 %의 에탄올로 복부를 살균하십시오. 인산완충식식염(PBS)으로 헹구어 자궁을 청소하십시오. 자궁을 멸균 플라스틱 10cm 접시에 넣습니다. 미세 절 가위를 사용하여 영역을 포함하는 각 데시두아를 서로 분리합니다. 자궁 근육을 벗겨 내고 모든 데키다큐를 노출하십시오. 하나씩 각 배아에서 데시두아를 제거합니다. 각 배아에서 노른자 주머니를 제거하고 지노티핑을 위해 저장합니다. 모든 배아를 이미징을 위해 신선한 PBS의 새로운 접시로 이동합니다. 전체 쓰레기의 이미지를 가져 가라. 각 배아를 개별적으로 이미지화하고 각 배아의 소미트 수를 계산합니다. 배율과 노출(형광용)을 실험 간에 동일하게 유지합니다.참고: 50-200ms 노출이 형광에 적합하며 20ms는 밝은 필드 설정에 적절하다는 것을 발견했습니다. 2. 배아 해리 및 세포 분류 각 배아에서 정렬할 수 있도록 다음을 수행하십시오. E8.0보다 오래된 배아를 위한 오틱 플라코드 바로 위에 참수하십시오(두개골 부위의 표지된 세포만 원하는 경우). E7.5 배아의 경우, 엑스트라배아 구조를 제거하십시오(적절한 배아만 원하는 경우). 48웰 플레이트의 깨끗한 우물로 머리를 최소한의 PBS로 이동합니다. 250 μL의 파파인(27 U/mL)을 추가합니다. p200을 사용하여 부드럽게 위아래로 파이펫. 현미경의 밑에 확인하고 덩어리와 단 하나 세포를 찾아보십시오. 단일 셀 서스펜션이 달성 될 때까지 위아래로 부드러운 파이펫을 반복하십시오 (일반적으로 E7.5-E9.5의 경우 30 초에서 1 분 사이로 동일시되어야하는 위아래로 파이펫팅의 세 라운드). 태아 소 혈청 (FBS)의 250 μL로 담금질. 각 배아를 정렬하는 단계 2.1.1-2.1.5를 반복한다. 35 μm 나일론 메쉬 필터 캡 튜브를 통해 셀 서스펜션 500 μL을 걸러 서 덩어리를 제거합니다. 여과물을 가지고 새로운 1.5 mL 튜브로 이동하고 5 분 동안 200 x g에서 회전. 주체를 조심스럽게 제거하고 새로운 튜브로 옮김하십시오 (살아있는 세포가 펠릿에 있는 것으로 알려질 때까지 저장하십시오). 0.5-1% 소 세럼 알부민을 함유한 PBS의 300 μL에서 세포 펠릿을 재일시 중단하고 정렬될 때까지 얼음을 유지합니다(현재와 정렬 종료 사이의 시간을 최소화). 원하는 경우, 셀 서스펜션의 10 μL을 가지고 Trypan 블루의 10 μL (0.4%)와 결합 그리고 혈종계를 사용하여 Trypan 블루만 죽은 세포를 얼룩으로 대략적인 세포 정량화 및 생존성을 식별합니다. 정렬 직전에 필터 캡 튜브를 통해 각 샘플을 다시 필터링하고 라이브 셀에 DAPI 얼룩을 추가합니다. 각 샘플을 RNA 추출 용액 500 μL(재료 표참조)로 70 μm 노즐로 셀 선별기로 정렬합니다. 모든 샘플을 수확할 때까지 -80°C에서 혼합하고 보관하십시오. 이 시점에서는 실험에 필요한 모든 샘플을 수확하여 라이브러리 준비 라운드 간의 기술적 변동을 줄일 수 있습니다. 3. RNA 추출 참고: 프로토콜은 RNA 절연 키트로부터 조정됩니다. 재료 표를 참조하십시오. RNA 추출 용액 500μL(재료 표참조)을 각 샘플에 추가하여 총 부피 1000 μL을 만듭니다. 각 샘플을 실온에서 해동합니다. 1.5 분 동안 각 샘플을 소용돌이, 균일화를 시작하기 전에 캡이 각 튜브에 안전하게 있는지 확인. 실온(15-25°C)에서 5분 동안 동형어를 배양한다. 140 μL의 클로로폼을 추가하고 캡 튜브를 단단히 넣고 15s를 위해 힘차게 흔들어 줍니다. 실온에서 3분 동안 배양하십시오. 4°C에서 12,000 x g에서 15분 동안 원심분리기. 상부 수성 위상을 얼음 위에 새 수집 튜브로 옮기습니다. 단계 간 또는 유기 단계를 전송하지 마십시오. 분홍색 유기 단계에 접근할 때 튜브를 옆으로 팁으로 팁을 주어 명확한 수성 상이 수집될 수 없을 때까지 작은 알리쿼트를 제거합니다. 다음 단계에서 올바른 계산을 위해 각 샘플에서 수집된 수성 상이 포함된 RNA의 부피를 측정합니다. 100% 에탄올의 1.5부부(보통 525μL)를 추가하고 파이펫팅으로 철저히 섞는다. 침전을 포함하여 최대 700μL 샘플이 2mL 수집 튜브의 컬럼으로 들어갑니다. 실온에서 15s에 대해 ≥8,000 x g의 뚜껑과 원심분리기를 닫습니다. 흐름을 삭제합니다. 샘플의 나머지 부분을 사용하여 3.8 단계를 반복합니다. 제조업체 지침에 따라 열을 세척합니다. 1 분 동안 최고 속도로 회전하여 열을 건조. 컬럼을 새로운 1.5mL 수집 튜브로 전송합니다. 메막 의 중앙에 핵자유물의 파이펫 11 μL. 실온에서 1분 동안 앉습니다. 최대 속도를 1분 회전하여 열을 벗어날 수 있습니다. 분광계 및 평행 모세관 전기 포근기구(재료표)를 사용하여 RNA 농도를측정한다. 4. 도서관 준비 참고 : 프로토콜은 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에서 적응; 재료 표를참조하십시오. 3′ 어댑터의 1/4 희석을 사용하여 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에 명시된 바와 같이 데마처레이션 및 3′ 어댑터 결찰을 완료합니다. 3′ 어댑터 제거를 계속합니다. 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에 명시된 대로 어댑터 고갈을 완료하십시오. 비드 클렌징을 위해 신선하게 준비된 80% 에탄올을 사용하고 모든 과잉 에탄올이 비드를 과도하게 건조시키지 않고 뉴클레아제없는 물로 재서스펜션 직전에 완전히 제거된다는 것을 반드시 사용하십시오 (비드 펠릿의 균열은 과다 건조 시 관찰됩니다). 초과 어댑터 비활성화로 직접 진행합니다. 얼음에 모든 시약을 조립 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에 명시된 대로 초과 어댑터 불활성화를 완료합니다. 5′ 4N 어댑터 리차션을 계속 합니다. 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에 명시된 대로 5′ 어댑터 결찰을 완료하여 5′ 어댑터의 1/4 희석을 사용하고 모든 시약을 얼음에 조립합니다. 전사를 반전으로 진행합니다. 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에 명시된 바와 같이 완전한 역전사-첫 번째 가닥 합성을 통해 얼음에 대한 모든 시약을 조립하고 장기간 냉동고에서 효소를 유지하지 않도록 주의한다.참고: 이 시점에서 프로토콜은 4°C에서 하룻밤 사이에 저장된 샘플을 사용하여 프로토콜을 중지할 수 있습니다. 또는 PCR 증폭을 계속합니다. 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에 명시된 대로 시약을 조립하고 PCR 사이클수를 최소화하여 PCR 증폭을 완료합니다. PCR 주기의 수는 각 응용 프로그램에 대해 실험적으로 결정되어야 하며 최소 사이클 수를 사용해야 합니다. 여기서 우리는 우리의 작은 RNA 라이브러리를 성공적으로 증폭하기 위하여 16 주기를 이용했습니다. 크기 선택으로 직접 진행합니다. 5. 크기 선택 각 샘플에 6x 젤 로딩 염료와 파이펫 5 μL을 추가하여 혼합합니다. 10 μL의 사다리를 젤의 첫 번째 우물에 적재하여 우물을 오른쪽 빈 상태로 즉시 남깁니다. 모든 제품을 5.1 단계에서 6% 트리/붕산/에틸렌디아민트라아세트산에 적재하고 폴리아크라이알라미드 젤(TBE-PAGE)을 각 시료 사이에 1레인을 둡니다.참고: 다음 단계를 위해 젤이 들어온 용기를 보관하십시오. 0.5배 TBE 러닝 버퍼에서 약 30-40분 동안 150V에서 젤을 실행하십시오(하부 염료 밴드가 겔 의 바닥 근처에 있을 때까지, 0.5-1 cm). 젤이 실행되는 동안 염색 용액 1 L을 확인하십시오: SYBR 골드는 0.5배 TBE로 1:10,000을 희석시켰습니다. 젤이 실행이 완료되면 (즉, 하부 염료 밴드는 젤의 바닥 근처에 있음), 조심스럽게 젤의 방향을 지적, 유리 플레이트에서 젤을 제거합니다. 원래 포장의 트레이에 젤을 놓습니다. 0.5x TBE를 제거하고 5.5단계에서 염색 용액으로 교체하십시오. 스테인 젤15 분 동안. 염색 시간을 늘려야 할 수도 있습니다. UV 트랜실루미나이터에 젤을 놓고, 겔을 찢지 않도록 주의하고 위에서 언급한 방향을 유지합니다(사다리 의 밴드가 명확하게 볼 수 없는 경우 추가 시간 동안 다시 얼룩). 카메라가 있는 UV 트랜틸루미너에 염색이 완료되면 젤을 이미지합니다. 더 나은 이미지가 필요한 경우, 먼저 UV 트랜실루미너 이외의 이미징 장치를 사용하여 UV 트랜일루미노이터에서 직접 이미징으로 UV 트랜일루미노터에서 밴드를 절단하기 전에 겔의 이미지를 캡처하면 도 3A-B에도시된 바와 같이 배경의 가변 색소를 일으킨다. 젤이 섬세하고 찢어질 수 있으므로 너무 여러 번 이동하지 마십시오. 깨끗한 면도날을 사용하여 ~150bp 대역을 식별하고 제거하고 깨끗한 1.5mL 튜브에 넣습니다. ~130 bp 대역(어댑터 디머 제품)을 잘라내지 마십시오. 문서화 를 위해 라이브러리 제품을 포함하는 조각을 제거 한 후 젤을 다시 이미지합니다. 젤 슬라이스를 함유한 마이크로센심분리기 튜브를 최대 속도로 30초간 회전하여 각 튜브의 하단에 있는 슬라이스를 수집합니다. 각 샘플에 p200 팁을 사용하여 젤 조각을 가능한 가장 작은 비트로 분쇄하십시오. 각 팁을 각 튜브로 배출합니다. 각 튜브에 300 μL의 용출 버퍼를 추가하여 튜브 측면에서 젤 비트를 세척하고 p200 팁을 다시 부착하고 각 샘플의 팁을 씻어 냅니다. 25°C로 설정된 흔들리는 인큐베이터에 용출 샘플을 놓습니다. 하룻밤 사이에 1000 rpm 흔들림으로 배양하십시오. 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 실온에서 최대 속도로 10 분 동안 회전하십시오. 라이브러리 제품을 포함하는 상체를 2mL RNase 무료 96 웰 플레이트로 전송합니다. 젤을 옮기지 않도록 주의하십시오. 각 샘플에 50 μL 정리 구슬을 추가하고 파이펫팅하여 혼합합니다. 즉시 350 μL의 이소프로판올을 넣고 파이펫팅으로 섞습니다. 실온에서 10분 동안 배양하여 흔들리면 됩니다. 펄스 스핀 플레이트를 펠릿 구슬로 한 다음 2 분 동안 자화하십시오. 상체를 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 80% 에탄올의 950 μL을 추가합니다. 30s에 대한 인큐베이션. 모든 상체를 제거합니다. 총 2개의 에탄올 세시에 대해 반복합니다. 3 분 동안 샘플을 건조. 이 단계에서각 우물의 바닥에서 수집되는 잔류 에탄올 (한 번 이상)을 제거하고 비드를 과도하게 건조시키지 않도록주의하십시오 (과도하게 건조하면 비드 펠릿이 균열될 것입니다). 우물 바닥에 있는 잔류 액을 모두 제거합니다. 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 13 μL의 재서스펜션 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다. 균일할 때까지 파이펫으로 섞습니다. 2 분 동안 배양 한 다음 3 분 동안 자화하십시오. 12 μL의 상류체를 깨끗한 튜브 또는 깨끗한 접시로 옮겨 후속 보관을 합니다. 모든 샘플을 하룻밤 사이에 4°C 또는 -20°C의 장기저장합니다. 모세관 전기포고감도 DNA 분석체를 사용하여 각 라이브러리에 존재하는 단편의 크기와 농도를 확인한다. 하나 이상의 방법으로 농도를 확인합니다.참고: 우리는 때때로 모세관 전기 포근을 과부하하지 않도록 표준 감도 키트를 사용했습니다.