为早期小鼠胚胎测序准备小型RNA库

所有研究和动物护理程序均获得贝勒医学院机构动物护理和使用委员会的批准，并存放在贝勒医学院实验室动物护理评估和认证协会批准的动物设施中。所有菌株都保持在C57BL6背景。 1. 胚胎解剖 （E7.5-E9.5） 从怀孕的雌性小鼠上取下子宫角，用70%乙醇对腹部进行消毒，并在那里进行切口。 使用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗来清洁子宫。将子宫放入无菌塑料10厘米的盘子中。 使用微切除剪刀，将每个含有区域的德奎亚彼此分开。剥下子宫肌，露出所有十分。一个个，从每个胚胎中去除十分多远。 从每个胚胎中去除蛋黄囊，并保存基因分型。 将所有胚胎放入新鲜 PBS 的新盘中进行成像。 以整个垃圾的图像。分别对每个胚胎进行成像，并计算每个胚胎的卵子数量。在实验之间保持放大和曝光（荧光）相同。注：我们发现50-200ms的曝光足以进行荧光，20ms的暴露足以进行明亮的磁场设置。 2. 胚胎分离和细胞分选 对于要从中排序的每个胚胎，请执行以下操作。 对于年龄超过 E8.0 的胚胎，在 otic 质码正上方斩首（如果只需要需要颅骨区域的标记细胞）。对于 E7.5 胚胎，去除外质结构（如果只需要胚胎本身）。 将头以最小体积的 PBS 移动到 48 井板的清洁井中。添加 250 μL 的木瓜 （27 U/mL）。使用 p200 轻轻地上下移位。 在显微镜下检查并寻找团块和单细胞。 重复温和移液上下，直到实现单个细胞悬浮（通常三轮移液向上和向下，这应该相当于30秒至1分钟之间的E7.5-E9.5）。 用250μL的胎儿牛血清（FBS）淬火。 对要排序的每个胚胎重复步骤 2.1.1-2.1.5。 通过 35 μm 尼龙网滤盖管过滤 500 μL 的电池悬浮液，以去除团块。 采取过滤和移动到新的1.5 mL管和旋转在200 x g 5分钟。小心地去除上一液并转移到新管中（保存，直到已知活细胞在颗粒中）。 在含有0.5-1%牛血清白蛋白的300μLPBS中重新增加细胞颗粒，并一直冰上直到分拣（尽量减少从现在起和分拣结束的时间）。 如果需要，服用 10 μL 的细胞悬浮液，并结合 10 μL 的 Trypan 蓝色 （0.4%）并使用血细胞计来识别近似细胞的定量和生存能力，因为 Trypan Blue 只弄脏死细胞。 在分拣之前，通过滤芯管再次过滤每个样品，并添加活细胞的DAPI污渍。 将每个样品分拣成 70 μm 喷嘴的细胞分拣 器上的 RNA 提取解液 500 μL（参见材料表）。 在-80°C下混合和储存，直到收获所有样品。只有当采集实验所需的所有样本以减少库准备之间的技术差异时，才从这一点开始。 3. RNA提取 注：该协议由RNA分离试剂盒改编;请参阅 材料表。 在每个样品中加入500μL的RNA提取解液（ 参见材料表），使总体积为1000μL。 在室温下解冻每个样品。 在开始均质化之前，每个样品的涡流1.5分钟，确保盖子牢固地固定在每个管上。在室温（15~25°C）下孵育均质5分钟。 加入140μL的氯仿，盖管牢固，并大力摇动15s。在室温下孵育3分钟。 在 4 °C 下以 12，000 x g 的温度下离心 15 分钟。 将上水相转移到冰上新的收集管。不要转移任何相间或任何有机相。接近粉红色有机相时，将管子倾斜到一边，取出小等分，直到无法收集到明显的水相。 测量从每个样品中收集的含有水相的RNA体积，以在下一步进行正确的计算。 加入 1.5 体积（通常为 525 μL，但可能略多或少），100% 乙醇，通过移液彻底混合。 在 2 mL 收集管中，将高达 700 μL 的样品（包括任何沉淀物）放入柱中。在室温下，以 ≥ 8，000 x g 的 15 s 关闭盖子并离心机。丢弃流式。 使用示例的其余部分重复步骤 3.8。 根据制造商说明清洗柱。全速旋转1分钟，将柱部干燥。将柱转移到新的 1.5 mL 收集管。 移液 11 μL 的核酸酶自由水到膜的中心。让我们在室温下坐1分钟。旋转最大速度 1 分钟，以从柱子上滑出。 使用分光光度计和平行毛细管电泳仪测量RNA浓度（材料表）。 4. 图书馆编制 注：该协议改编自小型RNA库制备套件手册;请参阅 材料表。 使用 3′ 适配器的 1/4 稀释，完成小型 RNA 库制备套件手册中所述的变性和 3′ 适配器连接。 继续多余的 3′ 适配器删除。 完成小RNA库准备套件手册中所述的适配器损耗。请务必使用新鲜准备好的 80% 乙醇进行珠子清理，并且所有多余的乙醇在无核酸酶水中重新吸收之前完全去除，而不会过度干燥珠子（在过度干燥时观察到珠子颗粒的裂解）。 直接转到多余的适配器失活。 完成多余适配器失活，如小型 RNA 库制备套件手册中所述，在冰上组装所有试剂。 继续 5′ 4N 适配器连接。 完成 5′ 适配器连接，如小型 RNA 库准备套件手册中所述，确保使用 5′ 适配器的 1/4 稀释，并在冰上组装所有试剂。 继续转录。 完整的逆转录第一链合成，如小型RNA库准备套件手册所述，并注意将所有试剂组装在冰上，而不是长时间将酶留在冰柜外。注：此时，协议可能会停止，样品在 4 °C 下隔夜存储。 或者继续 PCR 扩增。 通过组装小型RNA库制备试剂盒手册中规定的试剂，并最大限度地减少PCR周期，完成PCR扩增。应根据每个应用的实验确定 PCR 周期数，并且应使用最小周期数。在这里，我们使用了16个周期成功地放大了我们的小型RNA库。 直接进行大小选择。 5. 尺寸选择 在每个样品中，加入5μL的6x凝胶加载染料和移液器混合。 将 10 μL 的梯子装载到凝胶的第一个井中，使井立即空空。将所有产品从步骤 5.1 装载到 6% 的三酯/乙酰胺四乙酸 + 聚丙烯酰胺凝胶 （TBE-PAGE） 上，并在每个样品之间留下 1 个通道。注：将凝胶进来的容器保留，以便执行后续步骤。 在 0.5 倍 TBE 运行缓冲液中以 150 V 的速度运行凝胶约 30-40 分钟（直到下部染料带靠近凝胶底部，0.5-1 厘米）。 在凝胶运行时制造 1 L 的染色溶液：SYBR 金在 0.5x TBE 中稀释 1：10，000。 当凝胶完成运行（即，下染料带靠近凝胶底部）时，请小心地从玻璃板上取下凝胶，注意凝胶的方向。 将凝胶放在其原始包装的托盘中。拆下 0.5x TBE，然后从步骤 5.5 中更换染色溶液。染色凝胶15分钟。染色时间可能需要增加。 将凝胶放在紫外线透光器上，注意不要撕裂凝胶并保持上述方向（如果无法清楚地看到梯子带，请重新染色以等待更多时间）。 使用相机在紫外线透光器上染色完成后对凝胶进行成像。 如果需要更好的图像，首先使用除紫外线透光器以外的成像设备来捕获凝胶的图像，然后再切断紫外线转光器上的带状光，因为直接在UV转光器上成像会导致背景的可变着色，如图 3A-B所示。不要移动凝胶太多次，因为它很细腻，可能会撕裂。 使用干净的剃须刀刀片识别和拆下 ±150 bp 带，并放入干净的 1.5 mL 管中。请勿切断 ±130 bp 频带（适配器二丁车产品）。 取出包含库产品的切片后，再次对凝胶进行图像，以便进行记录。 以最大速度旋转含有凝胶片的微离心管，以收集每个管底部的切片。 对每个样品使用 p200 尖端将凝胶片粉碎成尽可能小的位。将每个尖端喷射到每个管中。 在每个管上，加入300μL的洗脱缓冲液，注意从管的一侧清洗凝胶位，并重新连接p200尖端，并洗掉每个样品的尖端。 将孵化样品放在 25 °C 的摇培养箱中。 孵育过夜与1000 rpm震动。从培养箱中取出管子，在室温下以最大速度旋转 10 分钟。 将包含库产品的上一液转移到 2 mL RNase 无 96 井板中。注意不要转移任何凝胶。 将 50 μL 清洁珠添加到每个样品中，然后通过移液混合。立即加入350μL的异丙醇，通过移液混合。在室温下孵育10分钟，带摇。 脉冲旋转板颗粒珠，然后磁化2分钟。小心地取出并丢弃上一液。 加入950μL的80%乙醇。孵育30 s.卸下所有上一液。重复两次乙醇洗涤。 将样品干燥3分钟。在此步骤中，注意清除每个井底部收集的任何残留乙醇（不超过一次），并且不要过度干燥珠子（过度干燥将导致珠子颗粒开裂）。 清除井底的所有残留液体。从磁性支架上拆下板。 将颗粒重新在13μL的再增缓冲液中。通过移液器混合，直到均匀。孵育2分钟，然后磁化3分钟。 将 12 μL 的上清液转移到清洁管或清洁板井中，以便随后储存。将所有样品长期储存在4°C或-20°C。 使用毛细管电泳高灵敏度DNA测定，检查每个库中存在的片段的大小和浓度。使用多种方法确认浓度。注：我们偶尔使用标准灵敏度套件，以避免毛细管电泳过载。