In Situ Chemotaxis Assay zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens in aquatischen Ökosystemen
Özet
Hier wird das Protokoll für einen In-situ-Chemotaxis-Assay vorgestellt, ein kürzlich entwickeltes mikrofluidisches Gerät, das Studien des mikrobiellen Verhaltens direkt in der Umwelt ermöglicht.
Abstract
Mikrobielle Verhaltensweisen wie Motilität und Chemotaxis (die Fähigkeit einer Zelle, ihre Bewegung als Reaktion auf einen chemischen Gradienten zu verändern), sind in den bakteriellen und archaealen Bereichen weit verbreitet. Chemotaxis können in heterogenen Umgebungen erhebliche Vorteile beim Erwerb von Ressourcen mit sich bringen. Es spielt auch eine entscheidende Rolle bei symbiotischen Wechselwirkungen, Krankheiten und globalen Prozessen, wie biogeochemische Radfahren. Aktuelle Techniken beschränken jedoch die Chemotaxis-Forschung auf das Labor und sind im Feld nicht leicht anwendbar. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Einsatz des In-situ-Chemotaxis-Assays (ISCA) vorgestellt, einem Gerät, das eine robuste Abfrage von mikrobiellen Chemotaxis direkt in der natürlichen Umgebung ermöglicht. Die ISCA ist ein mikrofluidisches Gerät, das aus einem 20-Well-Array besteht, in das Chemikalien von Interesse geladen werden können. Einmal in wässrigen Umgebungen eingesetzt, diffundieren Chemikalien aus den Brunnen und erzeugen Konzentrationsgradienten, die Mikroben spüren und darauf reagieren, indem sie über Chemotaxis in die Brunnen schwimmen. Der Brunneninhalt kann dann beprobt und verwendet werden, um (1) die Stärke der chemotaktischen Reaktionen auf bestimmte Verbindungen durch Durchflusszytometrie zu quantifizieren, (2) isolierbare und kulturresponsive Mikroorganismen zu isolieren und (3) die Identität und das genomische Potenzial der antwortenden Populationen durch molekulare Techniken zu charakterisieren. Die ISCA ist eine flexible Plattform, die in jedem System mit wässriger Phase eingesetzt werden kann, einschließlich Meeres-, Süßwasser- und Bodenumgebungen.
Introduction
Verschiedene Mikroorganismen verwenden Beweglichkeit und Chemotaxis, um lückenhafte Nährstoffumgebungen auszubeuten, Wirte zu finden oder schädliche Bedingungen zu vermeiden1,2,3. Diese mikrobiellen Verhaltensweisen können wiederum die Raten der chemischen Transformation beeinflussen4 und symbiotische Partnerschaften in terrestrischen, Süßwasser- und marinen Ökosystemen fördern2,5.
Chemotaxis wurde in den letzten 60 Jahren unter Laborbedingungen ausgiebig untersucht6. Die erste quantitative Methode zur Untersuchung von Chemotaxis, der Kapillar-Assay, beinhaltet ein Kapillarrohr, das mit einem vermeintlichen Chemolockant gefüllt ist, das in eine Suspension von Bakterien eingetaucht ist6. Die Diffusion der Chemikalie aus dem Rohr erzeugt einen chemischen Gradienten, und chemotaktische Bakterien reagieren auf diesen Gradienten, indem sie in die Röhre7wandern. Seit der Entwicklung des Kapillar-Assays, der heute noch weit verbreitet ist, wurden viele andere Techniken entwickelt, um Chemotaxis unter zunehmend kontrollierten physikalisch-chemischen Bedingungen zu untersuchen, wobei die jüngste mit der Verwendung von Mikrofluidik8,9,10.
Mikrofluidik, zusammen mit Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie, ermöglicht die Verfolgung des Verhaltens einzelner Zellen als Reaktion auf sorgfältig kontrollierte Gradienten. Obwohl diese Techniken unser Verständnis von Chemotaxis erheblich verbessert haben, wurden sie auf den Einsatz im Labor beschränkt und übersetzen sich nicht leicht in den Einsatz in Umweltsystemen. Infolgedessen wurde die Fähigkeit natürlicher Bakteriengemeinschaften, Chemotaxis in natürlichen Ökosystemen zu verwenden, nicht untersucht; Daher ist das derzeitige Verständnis der potenziellen ökologischen Bedeutung von Chemotaxis auf künstliche Laborbedingungen und eine begrenzte Anzahl von laborkultivierten bakteriellen Isolaten ausgerichtet. Die kürzlich entwickelte ISCA überwindet diese Einschränkungen11.
Die ISCA baut auf dem allgemeinen Prinzip des Kapillar-Assays auf; Es nutzt jedoch moderne Mikrofabrikationstechniken, um eine hochgradig replizierte, leicht einsetzbare experimentelle Plattform für die Quantifizierung von Chemotaxis zu Verbindungen zu liefern, die für die natürliche Umwelt von Interesse sind. Es ermöglicht auch die Identifizierung und Charakterisierung von chemotaktischen Mikroorganismen durch direkte Isolierung oder molekulare Techniken. Während das erste Arbeitsgerät selbstgefertigt und aus Glas und PDMS11gebaut wurde, besteht die neueste spritzgegossene Version aus Polycarbonat, wobei ein hochstandardisiertes Herstellungsverfahren verwendet wird (für Interesse an der neuesten Version des Geräts können die entsprechenden Autoren kontaktiert werden).
Der ISCA ist Kreditkartengröße und besteht aus 20 Brunnen, die in einem 5 x 4-Well-Array verteilt sind, die jeweils durch einen kleinen Port (800 m Durchmesser) mit der äußeren aquatischen Umgebung verbunden sind. Abbildung 1). Vermeintliche Chemoattractants, die über den Hafen in die Brunnen geladen werden, diffundieren in die Umgebung, und chemotaktische Mikroben reagieren, indem sie durch den Hafen in den Brunnen schwimmen. Da viele Faktoren das Ergebnis eines ISCA-Experiments in der natürlichen Umgebung beeinflussen können, wird dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll neuen Benutzern helfen, potenzielle Hürden zu überwinden und effektive Bereitstellungen zu erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Auf der Skala der aquatischen Mikroorganismen ist die Umwelt bei weitem nicht homogen und ist oft durch physikalische/chemische Gradienten gekennzeichnet, die mikrobielle Gemeinschaften1,15strukturieren. Die Fähigkeit von motilen Mikroorganismen, Verhalten (d.h. Chemotaxis) zu verwenden, erleichtert die Nahrungsaufnahme innerhalb dieser heterogenen Mikroumgebungen1. Das Studium von Chemotaxis direkt in der Umwelt hat das Potenzial, wichti…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde zum Teil von der Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative finanziert, indem sie GBMF3801 an J.R.S. und R.S., und einen Investigator Award (GBMF3783) an R.S. sowie ein Australian Research Council Fellowship (DE160100636) an J.B.R., eine Auszeichnung der Simons Foundation an B.S.L. (594111) und ein Stipendium der Simons Foundation (542395) an R.S. im Rahmen der Principles of Microbial Ecosystems (PriME) Collaborative.
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
Referanslar
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Mikrobiyoloji. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
