時間的および空間的に分離された細胞集団を標的とする子宮エレクトロポレーションの二重

大脳皮質は非常に複雑で複雑に組織化された構造です。このような組織の程度を達成するために、皮質投影ニューロンは、その側頭発生、皮質プレート内の最終目的地への移行、および短距離および長距離接続^{の確立1、22}を必要とする複雑な発達過程を経る。長い間、コルチコ形成を研究する古典的な方法は、関心のある遺伝子のノックアウトまたはノックインマウスモデルの使用に基づいていました。しかし、この戦略、特に条件付きノックアウトマウスの使用は時間と高価であり、遺伝的冗長性の存在や特定のCREドライバの欠如などに関する追加の問題を提示することがあります。これらの問題に対処するために生じたアプローチの1つは、今日では皮質の発達を研究するために広く使用されている、子宮エレクトロポレーション^33、44です。子宮内エレクトロポレーションは、体細胞トランスジェネシスに使用される技術であり、神経幹細胞およびその子孫を生体内で標的化することを可能にする。この方法は^、インビボでの遺伝子操作(すなわち、機能アッセイの利得または^{,損失)7、8、9、8}生体⁹外および培養細胞^8、10における電気泳動皮質を単離するための蛍光タンパク質^105、6の発現によって細胞を標識するために使用することができる。⁵⁶さらに、子宮内のエレクトロポレーションでは、標的領域の時間的および地域的制御が可能である。この技術は、多くの用途を有し、広く神経移動、幹細胞分裂、神経結合性、および他の被験者^{898、9、11、1211,12}を研究するために使用されています。^,

現在の原稿は、子宮エレクトロポレーションで二重と呼ぶ子宮エレクトロポレーション変異体の使用を記述し、異なる時間的および空間的起源を有する大脳皮質における細胞の相互作用を分析する。これらの研究は、いくつかのトランスジェニックラインの組み合わせ使用を必要とするため、マウスモデルを採用する際に完了するには非常に複雑です。本論文に記載されているプロトコルの応用例としては、隣接する細胞間の密接な相互作用の研究や、長距離投影による遠距離細胞間の相互作用の研究が挙げられる。この方法では、同じ胚上で時間的および空間的に分離された子宮エレクトロポレーション手術において2つの独立した独立を行い、関心のある異なる細胞集団を標的とする。このアプローチの利点は、野生型動物を使用して一方または両方のタイプのニューロンで遺伝子機能を操作する可能性です。さらに、これらの機能実験は、細胞質または膜タグ付き蛍光タンパク質の発現と組み合わせて、樹状突起および軸索を含む標的細胞の微細形態を可視化し、細胞相互作用の可能性のある差異をコントロール(すなわち、蛍光タンパク質で標識した細胞のみ)に比較して分析することができる。

ここで説明するプロトコルは、新皮質内の細胞相互作用の研究に焦点を当てていますが、この戦略は、小脳¹⁵のような他の構造のサブパラリウムまたは視床^{13、14、,14}または他の構造の細胞間相互作用のような子宮エレクトロポレーションで標的とすることができる皮質外領域との相互作用を調べるためにも使用できます。異なる領域のターゲット設定は、電極の向きとDNAが注入される心室(側面、第3、または第4)に基づいています。ここで説明した戦略では、機能実験における結合性/インナビネーションの一般的な変化を評価するのに役立つ、かなりの数の細胞にラベルを付けることができます。それにもかかわらず、接続性の微細な変化を研究するために、子宮エレクトロポレーション中の改変版を使用して、まばらな標識を得て、単一細胞¹⁶を同定することができる。要約すると、子宮内の二重エレクトロポレーションは、時間的および空間的に分離された細胞集団を標的化し、制御条件下でまたは機能的実験と組み合わせて、それらの相互作用を詳細に研究することを可能にする汎用性の高い方法であり、時間的および経済的コストを大幅に削減する。