다능성 줄기 세포에서 인간 대식세포의 생산 및 특성화

참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 시약 및 장비는 재료 표에나열되어 있습니다. 배지는 세포 배양을 위해 37°C에 있어야 한다. 분화 프로토콜에 사용되는 미디어 및 시약은 멸균되어야 합니다. 1. 인간 iPSC 라인 해동 및 유지 보수 세포 유지 배지, 성장 인자 및 기타 시약을 준비한다. hESC-SFM 프리 미디어(hESC-SFM; 재료 표참조)를 hESC 보충제로 DULbecco의 수정된 이글 미디엄 F12(DMEM/F12) 보충, 1.8% w/v 소 세럼 알부민(BSA), 0.1 mM 2-메르카포에탄올을 보충합니다. ( 인간 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 스톡 용액(10 μg/mL)을 멸균 된 0.1 % 인간 혈청 알부민 (HSA)-인산 완충 식염수 용액에 용해시킴으로써 준비합니다. 냉동튜브에 200 μL aliquots로 스톡 솔루션을 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 1 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 bFGF는 7일 동안 4°C에서 저장될 수 있다. 로키나아제 억제제(ROCK Inhibitor)-Y27632 스톡 용액(1 mg/mL)을 멸균수에 용해시켜 준비합니다. 냉동튜브에 50 μL aliquots로 스톡 솔루션을 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 1 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 ROCK 억제제는 7일 동안 4°C에서 보관될 수 있다. 줄기 세포 기질을 희석 (재료 표참조) 1:50 칼슘과 마그네슘과 덜베코의 인산 완충 식염수. 희석된 줄기세포 기판 용액을 배양판에 놓아 표면적당 최종2부피가 78 μL/cm2가 되도록 한다. 6 웰 플레이트의 우물을 코팅하려면 750 μL의 용액을 추가하십시오. 코팅된 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서허프화된 분위기에서 1시간 동안 배양한다. 줄기 세포 기질 코팅을 흡인하고 20 ng/mL bFGF 및 10 μM ROCK 억제제로 보충된 hESC 1 mL을 첨가합니다. 동결된 인간 iPSC 세포의 바이알을 해동하기 위해, 해동될 때까지 37°C에서 바이알을 배양하고 세포를 5 mL hESC-SFM 매체로 옮김을 전달한다. 원심분리기 세포는 100 x g에서 3 분 동안. 0.5 mL hESC-SFM에 20 ng/mL bFGF 및 10 μM ROCK 억제제를 보충하여 다시 중단합니다. 코팅된 세포를 잘 전사한다. 배양 세포24 시간. 20 ng/mL bFGF로 보충된 hESC-SFM으로 미디어를 변경하지만 ROCK 억제제는 없습니다. 세포를 유지하려면 세포가 80 % 합류에 도달 할 때까지 매일 배지를 변경하십시오. 미분화 iPSCs는 일반적으로 80% 동률에 도달하는 데 3-4일이 소요됩니다. 일단 세포가 80% 합류에 도달하면, 통로 세포. 20 ng/mL bFGF(ROCK 억제제 제외)로 보충된 1.5 mL의 신선한 hESC-SFM으로 소비배양 배지를 대체합니다. 배양 용기를 한 손에 들고 일회용 셀 패서징 도구(재료 표참조)를 한 방향으로(즉, 왼쪽에서 오른쪽으로) 플레이트를 가로질러 굴려보세요. 롤러의 모든 블레이드가 플레이트에 닿아야 합니다. 롤링 하는 동안 균일 한 압력을 유지 합니다. 전체 우물이 덮일 때까지 같은 방향으로 반복 롤링하십시오. 배양 용기를 90° 회전하고 1.12.2 및 1.12.3 단계에 설명된 대로 반복 압연한다. 사용 후에는 패시징 도구를 폐기하십시오. 멸균 피펫을 사용하여 우물의 매체를 사용하여 절단 식민지를 빼냅니다. 1:4 비율로 전코팅 된 줄기 세포 기질 웰 (단계 1.2-1.5)에서 웰 당 1.5 mL의 최종 미디어 볼륨 (hESC -SFM 보충 20 ng/mL bFGF). 2. 인간 iPSC 라인 동결 iPSC 세포를 동결하려면, hESC-SFM을 20 ng/mL bFGF 및 10 μM ROCK 억제제와 함께 6웰 플레이트의 70%-80% 웰웰의 매체로 교체하십시오. 37°C에서 잘 배양하고 1시간 동안 5%CO2를 배양한다. 세포 통과 도구로 식민지를 잘라 원심 분리 튜브에 빠진 식민지를 배치합니다. 원심분리기 세포는 100 x g에서 3 분 동안. 매질을 흡인하고 세포 동결 보존 매체의 1 mL에서 세포를 재중단시다(재료 표참조). 세포를 두 개의 저온 으로 동등하게 나누고 4 °C에서 미리 냉각 된 세포 냉동 보존 용기에 넣습니다. 24-48 시간 동안 -80 °C에서 세포를 저장합니다. 바이알을 -135°C 냉동고 또는 액체 질소 탱크로 옮김. 3. 인간 iPSC 대식세포에 대한 분화 참고: 도 1에대식세포 분화 프로토콜의 개략적 요약이 도시되어 있습니다. 세포 분화 성장 인자 및 기타 시약 준비 hESC-SFM 미디어 준비(이전 섹션 참조). 젤라틴을 멸균수로 용해시켜 돼지 젤라틴용 액을 0.1% w/v로 준비합니다. 젤라틴 용액은 최대 2 년 동안 4 °C에서 보관할 수 있습니다. BMP4를 4mM 염화수소(HCl)-0.2% BSA PBS 용액으로 용해시킴으로써 인간 BMP4 스톡 솔루션(25 μg/mL)을 준비합니다. 냉동튜브에 50 μL aliquots로 스톡 솔루션을 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 1 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 BMP4는 5일 동안 4°C에서 보관될 수 있다. VEGF를 0.2% BSA PBS 용액으로 용해시킴으로써 인간 VEGF 스톡 용액(100 μg/mL)을 준비한다. 냉동튜브에 스톡 솔루션을 10 μL aliquots로 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 1 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 VEGF는 7일 동안 4°C에서 보관될 수 있다. SCF를 0.2% BSA PBS 용액으로 용해시켜 인간 SCF 스톡 솔루션(100 μg/mL)을 준비합니다. 냉동튜브에 5 μL aliquots로 스톡 솔루션을 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 1 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 SCF는 10일 동안 4°C에서 보관될 수 있다. IL3를 0.2% BSA PBS 용액으로 용해시킴으로써 인간 IL3 스톡 솔루션(10 μg/mL)을 준비합니다. 냉동튜브에 500 μL aliquots로 스톡 솔루션을 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 2 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 SCF는 15일 동안 4°C에서 보관될 수 있다. CSF1을 0.2% BSA PBS 용액으로 용해시킴으로써 인간 CSF1 스톡 솔루션(10 μg/mL)을 준비합니다. 냉동튜브에서 1 mL aliquots로 스톡 솔루션을 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 2 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 SCF는 15일 동안 4°C에서 보관될 수 있다. 인터페론 감마(IFNg), 인터류킨 4(IL4), 인터류킨 10(IL10)의 분리된 10μg/mL 스톡 솔루션을 0.2% BSA PBS 용액으로 용해하여 준비합니다. 0.2% BSA PBS 용액으로 용해시킴으로써 리포폴리사카라이드(LPS)를 스톡 용액(100 U/mL)에 준비한다. 각 스톡 솔루션을 35 μL aliquots로 배포합니다. -80 °C에서 최대 2년 보관하십시오. 일단 해동되면, 주식은 7 일 동안 4 °C에서 저장 될 수있다. 1 단계 : 배아 시체 생성 (0 일째 – 3 일) 0일째에, 1단계 용지 2.25mL(hESC-SFM50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF, 20 ng/mL SCF)를 초저 부착 6 웰 플레이트의 두 개의 웰에 추가합니다. 6개의 웰 플레이트에서 iPSC의 80% 웰을 1.5mL의 스테이지 1 용지로 교체합니다. 셀 패싱 도구를 사용하여 식민지를 절단하고 피펫으로 절단 된 식민지를 초저 부착 6 웰 플레이트의 두 개의 우물로 옮니다 (재료 표참조). 2일째에, hESC-SFM 매체0.5 mL를 사용하여 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF 및 20 ng/mL SCF의 최종 농도로 사이토카인을 가져온다.참고: IPSC 식민지는 EB가 될 것입니다(그림 2A). 2 단계 : 현탁액에서 조혈 세포의 출현 4일째에, 6개의 웰 조직 배양판의 4웰을 0.1% w/v 젤라틴으로 코팅하고 적어도 10분 동안 배양한다. 젤라틴을 제거하고 2 단계 미디어 2.5 mL을 추가하십시오 (X-VIVO15 100 ng / mL CSF1, 25 ng / mL IL-3, 2 mM 글루타맥스, 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 및 0.055 mM 2-mercaptoethanol). 형성된 EB를 50mL 원심분리기 튜브에 모으고 중력에 의해 튜브 바닥에 정착할 수 있도록 합니다. 조심스럽게 미디어를 흡인. 스테이지 2 미디어의 2mL에서 EB를 다시 일시 중단합니다. 10-15 EB(15 이하)를 2.5 mL의 스테이지 2 용지를 함유하는 젤라틴 코팅 웰로 옮니다. 37°C 및 5%CO2 공기에서 EB를 배양합니다. 도금 된 EB의 미디어를 2-3 주 동안 3-4 일마다 변경하십시오. 후 2-3 주, EBs 는 현탁액으로 비 부착 조혈 세포를 방출하기 시작합니다.참고: 현탁액 세포 방출의 이 기간은 변화할 수 있고 세포주 의존적이다. 이러한 현탁액의 세포는 대식세포내로 수확 및 숙성될 수 있다(단계 3 참조)(도2A). 3 단계 : 말단 대식세포 성숙 현탁액 조혈 세포를 수집하고 EB 플레이트에 매질(Stage 2 media)을 보충합니다. 원심분리기 현탁액 세포를 200 x g에서 3분 동안. 3단계 매질에서 현탁액 세포를 다시 중단합니다(X-VIVO1510 ng/mL CSF1, 2 mM 글루타맥스 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충). 플레이트는 0.2 x 106 세포/mL의 밀도로 처리되지 않은 플라스틱 10cm 세균등급 플레이트(10 mL) 또는 코팅되지 않은 6웰 조직 배양플레이트(3 mL)에 세포를 수집하고 분사하였다. 9-11일 동안 스테이지 3 미디어에 세포를 보관하고 5일마다 미디어를 변경합니다.참고: 단계 3.4.1-3.4.5 단계 3-4 일마다 반복 될 수 있고 최대 3 개월 동안 원래 EB 플레이트에서 수확 된 현탁액 세포. 대식세포 편광 대식세포를 M(LPS + IFNg) 표현형으로 활성화하려면 LPS(최종 농도: 100 ng/mL) 및 IFNg(최종 농도: 10 U/mL)로 세포를 48시간 동안 자극합니다. 세포를 M(IL4) 표현형으로 활성화하려면 IL4(최종 농도: 20 ng/mL)로 세포를 자극합니다. M(IL10) 표현형을 활성화하려면 IL10(최종 농도: 5 ng/mL)으로 대식세포를 자극합니다. 4. iPSC 유래 대식세포 품질 관리 검사 혈세포계로 계산하여 EB의 6 웰 플레이트 당 생산되는 조혈 현탁액 세포의 수를 결정합니다. 앞에서 설명한 대로 대식세포 형태를 평가한다(예를 들어, 상용 키트 염색)8,,9. 앞서 설명한 바와 같이 유전자 발현 분석 및 유세포분석을 이용한 대식세포 특이적 마커 및 편광 마커의발현을 검출하는 8,,9. 대식세포의 6웰 플레이트 중 하나의 웰에서 유세포 분석 실험을 위해, 성숙매체를 흡인하여 세포를 수확하고, 2 mL의 PBS로 세척하고, 실온에서 5분 동안 2 mL의 효소 자유 세포 해리 버퍼로 배양합니다. 피펫을 위아래로 반복해서 분리하고 수확합니다. 혈세포계로 세포를 카운트하고 2% BSA, 0.5 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)-PBS 용액의 80 μL에서 세포를 재중단시켰다. MACS 인간 FC 차단제 20 μL을 추가합니다. 20 분 동안 얼음에 배양하고 빛으로부터 보호합니다. 2% BSA, 0.5 mM EDTA PBS 용액의 적절한 부피를 추가하여 세포 농도를 1 x 106 대식세포/mL로 가져옵니다. 얼룩 1 x 105 세포에서 100 μL의 2% BSA, 0.5 mM EDTA PBS 용액을 해당 항체와 함께 (아래 참고 참조) 및 빛으로부터 보호된 RT에서 15분 동안 배양한다. 2% BSA, 0.5 mM EDTA PBS의 적어도 100 μL로 1x를 씻으소서. 2% BSA, 0.5 mM EDTA PBS의 200 μL에서 세포를 다시 중단. 살아있는 죽은 염료로 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 희석 1:1,000)를 추가하십시오. 3 분 배양. 유세포분석의 경우, 주 모집단에 대한 게이트, 단일 세포, 그리고 살아있는 세포를 조사한다. 살아있는 세포 집단상, 대식세포 관련 마커 발현은분명하다(도 3A).참고: 항체는 대식세포를 도출하기 위하여 이용된 각 세포주를 위해 신중하게 적정되어야 합니다. 결과 섹션에 제시된 항체는 재료 표에있습니다. SFCi55-유래 대식세포 유세포 분석의 희석 인자도 포함된다. 5. 높은 처리량 식세포 분석 iPSC 유래 대식세포(iPSC-DM)를 매개체를 흡인하고, 얼음 차가운 효소 자유 세포 해리 버퍼를 추가하고, 5분 동안 배양하여 반복적으로 피펫팅하여 대식세포를 수집합니다. 플레이트 8 x 104 iPSC-DM은 이미징 조직 배양 등급 96 웰 플레이트(예를 들어, 셀캐리어 울트라, 퍼킨 엘머)의 웰 플레이트에서 적어도 2일 전에 200 μL의 3단계 배지에서 높은 처리량 이미징을 갖는다. pHrodoGreen Zymosan-A 바이오 입자는 PBS의 2 mL에서 1 개의 바이알을 재중단시킴으로써 준비합니다 (“용액 1”). 10 s에 대 한 소용돌이 솔루션. 더 많은 PBS (“용액 2”)로 PBS 비드 현탁액의 2 mL을 1:5로 희석하십시오. 10 s용 8 s용 소닉 액 액 2와 와류 용액을 4 °C로 유지하십시오. 이 솔루션은 5.11 단계에서 사용됩니다. 도금된 iPSC-DM의 용지를 제거하고 PBS로 세척합니다. Hoechst 33342를 함유하는 PBS 용액을 가진 얼룩 iPSC-DM은 1:20 희석되었다. 37 °C에서 20 분 동안 배양하십시오. PBS로 세포를 세척하십시오. 1:1,000을 희석한 깊은 적색 플라즈마 멤브레인 얼룩을 함유한 PBS 용액으로 얼룩을 제거하였다(재료 표참조). 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. PBS로 세포를 세척하십시오. iPSC-DM의 각 웰에 4°C로 유지된 비드 용액 100 μL을 추가합니다. 이제 플레이트가 이미징할 준비가 되었습니다. 고함량 이미징 시스템을 이용하여 플레이트를 이미지화하고 웰을 가로질러 3개 이상의 필드를 획득하여 웰의 좋은 표현을 얻었다. 콜럼버스 소프트웨어(고함량 이미징 분석 시스템 소프트웨어)를 사용하여 식세포증을 정량화합니다. 명확한 이미지 일괄 분석을 위해 특정 알고리즘을 개발할 수 있습니다. 파란색 강도를 측정하고 소프트웨어에서 파란색 신호가 핵을 나타낸다는 것을 정의합니다. 적색 강도를 측정하고 적색 신호가 세포질임을 나타내는 소프트웨어에서 정의합니다. 핵과 세포질이 함께 세포에 해당한다는 것을 정의합니다. 세포의 녹색 강도를 측정하고 세포를 식세포로 간주하기 위해 엄격한 컷오프/임계값을 설정합니다. 세포당 식세포 분획 및 평균 식세포 지수를 정량화한다. 비드 색상 강도는 비드의 수에 비례하기 때문에 식세포 활성은 섭취된 비드의 수에 의해 측정될 수 있다. 알고리즘/파이프라인을 모든 필드 내의 모든 이미지와 획득한 모든 시간 지점에 적용하여 강력하고 편견 없는 배치 접근 방식을 통해 세포의 식세포 기능을 결정할 수 있습니다.참고: Columbus는 세포 표현형 및 기능 테스트를 위한 세포 세분화 분석을 제공하는 고함량 분석 소프트웨어입니다.