ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート
Özet
従来のBODIPYコンジュゲートは、一過性形成、赤シフト地盤状態ダイマーの開発を通じて、生細胞単一分子局在化顕微鏡(SMLM)に使用することができます。我々は、生きている哺乳類および酵母細胞における細胞内中性脂質および脂肪酸をナノスコピック長さスケールで追跡し、解決するための最適化されたSMLMプロトコルを提示する。
Abstract
一分子局在化顕微鏡(SMLM)技術は、従来の蛍光顕微鏡の光学回折限界を克服し、細胞内構造と生体分子のダイナミクスを〜20nmの精度で解決することができます。SMLMの前提条件は、何千ものデータ取得フレームのそれぞれでポイントスプレッド機能の時空間的な重複を避けるために、暗い状態から蛍光状態に移行する蛍光HOREです。BODIPYは、従来の顕微鏡で使用される多数のコンジュゲートを備えた確立された染料です。赤シフトBODIPY地中状態ダイマー(DII)の一過性形成は、明るい単一分子放出をもたらし、単一分子局在顕微鏡(SMLM)を可能にする。ここでは、生きている酵母および哺乳類細胞における従来のBODIPYコンジュゲートを用いたSMLMのためのシンプルだが汎用性の高いプロトコルを提示する。この手順は、超解像画像を取得し、BODIPY-DII状態を追跡してBODIPYコンジュゲートの時空間的情報を抽出するために使用できます。この手順を応用して、ナノスコピック長さスケールで生きている酵母や哺乳動物細胞の脂質滴(LD)、脂肪酸、リソソームを解決します。また、他の蛍光プローブと併用した場合の、BODIPY色素によるマルチカラーイメージング能力を実証しています。我々の代表結果は、供給および断食条件下で酵母におけるBODIPY脂肪酸および中性脂質の差動空間分布および移動性を示す。SMLM用のこの最適化されたプロトコルは、市販の何百ものBODIPYコンジュゲートで使用することができ、この研究の用途をはるかに超えてナノスケールで生物学的プロセスを研究するのに有用なリソースです。
Introduction
確率的光学再構成顕微鏡(STORM)や光活性化局在化顕微鏡(PALM)などの単一分子局在化顕微鏡(SMLM)技術は、アッベの光学回折限界1,22を超える情報を持つ超解像画像を生成する方法として、そして単一1生体分子33,44のダイナミクスを追跡する方法として浮上している。SMLMと互換性のあるプローブの要件の1つは、ポイントスプレッド関数(PSF)の空間的な重複を避けるために、アクティブフルオロフォアの数をいつでも制御できることです。何千ものデータ取得フレームのそれぞれで、各蛍光蛍光蛍光色素の位置は、その対応するポイントスプレッド関数をフィッティングすることによって〜20 nmの精度で決定されます。従来、フルオロフォアのオンオフ点滅は、確率的な光スイッチング11、2、5、2,5または化学的に誘発された固有の点滅6によって制御されてきた。他のアプローチとしては、蛍光物質活性化タンパク質77,88への過渡的結合時の蛍光物質の誘導活性化と、全内部反射蛍光(TIRF)またはライトシート励起における標識DNAオリゴマーのプログラマブル結合結合(TIRF)が含まれる。最近、従来のホウ素二重火メタン(BODIPY)コンジュゲート11、12、1312,13の赤シフト二量体(DII)状態が一時的に形成され、赤シフト波長で特異的に励起され検出されるSMLM10の新しい多目的なラベリング戦略を報告しました。11
BODIPYs は、細胞下の区画と生体分子14,,15,,16に特異的に標識する何百もの変異体を有する色素として広く使用されている。生細胞での使いやすさと適用性のために、BODIPY変異体は従来の蛍光顕微鏡で市販されています。ここでは、何百もの市販のBODIPYコンジュゲートをライブセルSMLMに使用する方法に関する詳細かつ最適化されたプロトコルについて説明します。BODIPYモノマーの濃度を調整し、励起レーザーパワー、イメージング、データ解析パラメータを最適化することにより、生細胞で高品質の超高解像度画像と単一分子追跡データが得られます。低濃度(25-100 nM)で使用する場合、BODIPYコンジュゲートは、赤シフトチャネルのSMLMと従来の発光チャネルにおけるコナルコンルジェンス用蛍光顕微鏡に同時に使用することができます。得られた単一分子データを分析して、不動構造の空間的組織を定量化し、生細胞17における分子の拡散状態を抽出することができる。緑色と赤色の両方の形態のBODIPYプローブの利用可能性は、他の互換性のあるフルオロフォアとの適切な組み合わせで使用する場合、マルチカラーイメージングを可能にします。
本レポートでは、複数色のBODIPY-C 12、BODIPY(493/503)、BODIPY-C12赤、リソトラッカーグリーンを使用して、ライブセル12SMLMデータを取得および分析するための最適化されたプロトコルを提供します。生きている酵母細胞や哺乳動物細胞の脂肪酸と中性脂質を、30nmの分解能で分解します。さらに、酵母細胞が代謝状態に応じて外部付加脂肪酸の空間分布を調節することを実証する。加えたBODIPY-脂肪酸(FA)は、摂食条件下で小胞体(ER)および脂質液滴(LD)に局地的に局部化するのに対し、BODIPY-FAは断食時に血漿膜中に非LDクラスターを形成することを発見した。我々は、生きている哺乳動物細胞におけるリソソームおよびLDを画像化するために、この技術の応用をさらに拡大する。従来の BODIPY コンジュゲートを使用した SMLM 用の最適化プロトコルは、使用可能な無数の BODIPY コンジュゲートを使用してナノスケールで生物学的プロセスを研究するのに役立つリソースになります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、従来のBODIPYコンジュゲートを使用して、空間解像度の桁違いの改善を伴うSMLM画像を得る方法を実証しました。この方法は、従来のBODIPY色素の以前に報告された赤シフトDII状態を利用することに基づいており、これは二分子的な出会いを通じて一時的に形成される。これらの状態は、特に赤ずれた波長で励起され、検出され、SMLMには十分にまばらで短命です。レ…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本論文で報告された研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所が、受賞番号R21GM127965の下で支援した。
Materials
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror | |
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