Özet

Convenzionale BODIPY Coniugato per la microscopia a super-risoluzione a celle vive e il tracciamento a singola molecola

Published: June 08, 2020
doi:

Özet

I coniugati BODIPY convenzionali possono essere utilizzati per la microscopia per la localizzazione a singola molecola a cellule vive (SMLM) attraverso lo sfruttamento dei loro dimeri di stato del suolo con formazione transitoria e spostata verso il rosso. Vi presentiamo un protocollo SMLM ottimizzato per tracciare e risolvere i lipidi neutri subcellulari e gli acidi grassi nelle cellule viventi di mammiferi e lieviti alla scala nanoscopica della lunghezza.

Abstract

Le tecniche di microscopia per localizzazione a singola molecola (SMLM) superano il limite di diffrazione ottica della microscopia a fluorescenza convenzionale e possono risolvere le strutture intracellulari e la dinamica delle biomolecole con precisione di 20 nm. Un prerequisito per SMLM sono i fluorofori che passano da uno stato scuro a uno stato fluorescente per evitare la sovrapposizione spatio-temporale delle loro funzioni di diffusione dei punti in ciascuna delle migliaia di fotogrammi di acquisizione dei dati. I BODIPY sono coloranti consolidati con numerosi coniugati utilizzati nella microscopia convenzionale. La formazione transitoria di dimeri a stato del suolo BODIPY (DII)con spostamento rosso determina l’emissione luminosa di una singola molecola che consente la microscopia per la localizzazione a singola molecola (SMLM). Qui presentiamo un protocollo semplice ma versatile per SMLM con tradizionali coniugati BODIPY in cellule di lievito vivo e mammiferi. Questa procedura può essere utilizzata per acquisire immagini a super-risoluzione e per tenere traccia di singoli stati BODIPY-DII per estrarre informazioni spatio-temporali di BODIPY. Applichiamo questa procedura per risolvere le goccioline di lipidi (LD), gli acidi grassi e i lisosomi nelle cellule di lievito e mammiferi viventi su scala nanoscopica. Inoltre, dimostriamo la capacità di imaging multicolore con coloranti BODIPY se usato in combinazione con altre sonde fluorescenti. I nostri risultati rappresentativi mostrano la distribuzione spaziale differenziale e la mobilità degli acidi grassi BODIPY e dei lipidi neutri nel lievito in condizioni di alimentazione e digiuno. Questo protocollo ottimizzato per SMLM può essere utilizzato con centinaia di coniugati BODIPY disponibili in commercio ed è una risorsa utile per studiare i processi biologici su scala nanometrica ben oltre le applicazioni di questo lavoro.

Introduction

Le tecniche di microscopia di microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) come la microscopia stocastica della ricostruzione ottica (STORM) e la microscopia di localizzazione foto-attivata (PALM) sono emerse come metodi per generare immagini super-risoluzione con informazioni oltre il limite di diffrazione ottica di Abbe1,2 e per monitorare la dinamica delle singole biomolecole3,4. Uno dei requisiti per le sonde compatibili con SMLM è la capacità di controllare il numero di fluorofori attivi in qualsiasi momento per evitare la sovrapposizione spaziale delle loro funzioni di diffusione punti (PSF). In ognuna delle migliaia di frame di acquisizione dati, la posizione di ogni fluoroforo fluorescente fluorescente viene quindi determinata con una precisione di 20 nm adattando la funzione di diffusione dei punti corrispondente. Tradizionalmente, l’oscillazione dei fluorofori è stata controllata attraverso il fotoscambio stocastico1,2,5 o intrinseco indotto chimicamente6. Altri approcci includono l’attivazione indotta di fluorogeni al momento del legame transitorio con una proteina attivante fluorogena7,8 e l’annullamento programmabile di oligomeri di DNA etichettati nella fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) o nell’espirazione del foglio chiaro9. Recentemente, abbiamo segnalato una nuova e versatile strategia di etichettatura per SMLM10 in cui in precedenza segnalato stati dimeric dimeerici spostati in rosso (DII)di di-pyromethane di boro convenzionale (BODIPY) coniugati11,12,13 sono transitoriamente formando e diventare specificamente eccitato e rilevato con lunghezze d’onda rosso-spostato.

I BODIPY sono coloranti ampiamente utilizzati con centinaia di varianti che etichettano specificamente compartimenti subcellulari e biomolecole14,15,16. Grazie alla loro facilità d’uso e all’applicabilità nelle cellule viventi, le varianti BODIPY sono disponibili in commercio per la microscopia a fluorescenza convenzionale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato e ottimizzato su come le centinaia di coniugati BODIPY disponibili in commercio possono essere utilizzati per SMLM a cellule vive. Ottimizzando la concentrazione dei monomeri BODIPY e ottimizzando i poteri laser di eccitazione, i parametri di imaging e analisi dei dati, le immagini di alta qualità della super-risoluzione e i dati di tracciamento delle singole molecole si ottengono nelle cellule viventi. Se utilizzato a bassa concentrazione (25-100 nM), i coniugati BODIPY possono essere utilizzati simultaneamente per SMLM nel canale rosso e per la microscopia a fluorescenza convenzionale correlata nel canale di emissione convenzionale. I dati ottenuti a singola molecola possono essere analizzati per quantificare l’organizzazione spaziale delle strutture immobili e per estrarre gli stati diffusivi delle molecole nelle cellule viventi17. La disponibilità di sonde BODIPY sia in forma verde che rossa consente l’imaging multicolore se utilizzato nella giusta combinazione con altri fluorofori compatibili.

In questo rapporto, forniamo un protocollo ottimizzato per l’acquisizione e l’analisi dei dati SMLM delle cellule vive utilizzando BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rosso e lysotracker-verde in più colori. Risolviamo gli acidi grassi e i lipidi neutri in lieviti vivi e cellule di mammiferi con risoluzione di 30 nm. Dimostriamo inoltre che le cellule di lievito regolano la distribuzione spaziale degli acidi grassi aggiunti esternamente a seconda del loro stato metabolico. Troviamo che gli acidi grassi BODIPY aggiunti (FA) si localizzano al reticolo endoplasmico (ER) e alle goccioline di lipidi (LD) in condizioni di alimentazione, mentre i cluster BODIPY-FAs formano cluster non-LD nella membrana plasmatica al digiuno. Estendiamo ulteriormente l’applicazione di questa tecnica per immaginare lisosomi e LD nelle cellule di mammiferi viventi. Il nostro protocollo ottimizzato per SMLM che utilizza coniugati BODIPY convenzionali può essere una risorsa utile per studiare i processi biologici su scala nanometrica con la miriade di coniugati BODIPY disponibili.

Protocol

NOTA: Per la clonazione di lievito e l’etichettatura endogena si prega di fare riferimento alla nostra recente pubblicazione10. 1. Preparazione di campioni di cellule di lievito per l’imaging Preparare una coltura liquida durante la notte di un ceppo di lievito w303. Utilizzando un bastone di legno sterile, individuare una piccola quantità di cellule di lievito da una piastra di agar contenente lievito estratto–peptone-dextrose in un tubo di coltura con 2 m…

Representative Results

Qui, presentiamo un campione ottimizzato preparazione, acquisizione dei dati e procedura di analisi per SMLM utilizzando coniugato BODIPY in base al protocollo di cui sopra (Figura 1A). Per dimostrare un esempio del flusso di lavoro per l’acquisizione e l’analisi dei dati SMLM, utilizziamo BODIPY (493/503) in lievito per risolvere i LD al di sotto del limite di diffrazione ottica (Figura 1B-F). Esempi delle diverse modalità di imaging multicolo…

Discussion

In questo protocollo, abbiamo dimostrato come i coniugati BODIPY convenzionali possono essere utilizzati per ottenere immagini SMLM con un miglioramento dell’ordine di grandezza nella risoluzione spaziale. Questo metodo si basa sullo sfruttamento degli stati DII segnalati in precedenza di colori ROSSI di coloranti BODIPY convenzionali, che si formano transitoriamente attraverso incontri bimolecolari. Questi stati possono essere specificamente eccitati e rilevati con lunghezze d’onda spostate verso il rosso e s…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health con il numero di premio R21GM127965.

Materials

BODIPY C12 ThermoFisher D3822 Green fatty acid analog
BODIPY C12 Red ThermoFisher D3835 Red fatty acid analog
BODIPY(493/503) ThermoFisher D3922 Neutral lipid marker
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2010 Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base US Biological D9515 Amino acids for SCD
Dextrose Sigma-Aldrich G7021 Carbon source for SCD
Eight Well Cellvis C8-1.58-N Chambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek II Sigma-Aldrich Chambered Coverglasses
ET525/50 Chroma Bandpass filter
ET595/50 Chroma Bandpass filter
ET610/75 Chroma Bandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 Serum
FF652 Semrock Beam splitter
FF731/137 Semrock Bandpass filter
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 Cell culture medium
Hal4000 Zhuang Lab, Harvard University Data acquisition software
Ixon89Ultra DU-897U Andor EMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nm CW-OBIS Lasers for excitation
Insight3 Zhuang Lab, Harvard University Single molecule localization software
L-Glutamine Gibco 25030-081 Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solution ThermoFisher A14291DJ Imaging buffer
Lysotracker Green ThermoFisher L7526 Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A Nikon Oil immersion objective
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotics
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Supplement for cell culture
T562lpxr Chroma Beam splitter
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Dissociation of adherent cell
W303 MATa strain Horizon-Dharmacon YSC1058 Parental yeast strain
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y1250 Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdc Chroma Quadband dichroic mirror

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
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