Özet

Conjugués de BODIPY conventionnels pour la microscopie à super-résolution à cellules vives et le suivi à molécule unique

Published: June 08, 2020
doi:

Özet

Les conjugués conventionnels de BODIPY peuvent être employés pour la microscopie de localisation à cellule unique vivante (SMLM) par l’exploitation de leurs dimers terrestres de formation transitoire et à miettes rouges. Nous présentons un protocole SMLM optimisé pour suivre et résoudre les lipides neutres subcellulaires et les acides gras dans les cellules vivantes de mammifères et de levure à l’échelle de longueur nanoscopique.

Abstract

Les techniques de microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) surmontent la limite de diffraction optique de la microscopie conventionnelle de fluorescence et peuvent résoudre les structures intracellulaires et la dynamique des biomolécules avec une précision de 20 nm. Une condition préalable pour SMLM sont les fluorophores qui passent d’un état sombre à un état fluorescent afin d’éviter le chevauchement spatio-temporel de leurs fonctions de propagation de points dans chacun des milliers de cadres d’acquisition de données. Les BODIPY sont des colorants bien établis avec de nombreux conjugués utilisés dans la microscopie conventionnelle. La formation transitoire de dimers d’état au sol BODIPY (DII)à l’origine d’une seule molécule brillante permet une microscopie de localisation à une seule molécule (SMLM). Ici, nous présentons un protocole simple mais polyvalent pour SMLM avec des conjugués conventionnels BODIPY dans la levure vivante et les cellules de mammifères. Cette procédure peut être utilisée pour acquérir des images super-résolution et pour suivre les états seuls de BODIPY-DII pour extraire des informations spatio-temporelles des conjugués de BODIPY. Nous appliquons cette procédure pour résoudre les gouttelettes lipidiques (LD), les acides gras et les lysosomes dans la levure vivante et les cellules de mammifères à l’échelle de longueur nanoscopique. En outre, nous démontrons la capacité d’imagerie multi-couleurs avec des colorants BODIPY lorsqu’ils sont utilisés en conjonction avec d’autres sondes fluorescentes. Nos résultats représentatifs montrent la répartition spatiale différentielle et la mobilité des acides gras BODIPY et des lipides neutres dans la levure dans des conditions nourries et jeûnées. Ce protocole optimisé pour SMLM peut être utilisé avec des centaines de conjugués BODIPY disponibles dans le commerce et est une ressource utile pour étudier les processus biologiques à l’échelle nanométrique bien au-delà des applications de ce travail.

Introduction

Les techniques de microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) telles que la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et la microscopie localisée activée par photo (PALM) sont apparues comme des méthodes pour générer des images super-résolution avec des informations au-delà de la limite de diffraction optique d’Abbe1,2 et pour suivre la dynamique des biomoléculesuniques 3,4. L’une des exigences pour les sondes compatibles avec SMLM est la capacité de contrôler le nombre de fluorophores actifs à tout moment pour éviter le chevauchement spatial de leurs fonctions de propagation ponctuelle (PSF). Dans chacun des milliers d’images d’acquisition de données, l’emplacement de chaque fluorophores fluorescent est ensuite déterminé avec une précision de 20 nm en adaptant sa fonction de répartition ponctuelle correspondante. Traditionnellement, le clignotement on-off des fluorophores a été contrôlé par photoswitching stochastique1,2,5 ou chimiquement induite clignement intrinsèque6. D’autres approches incluent l’activation induite des fluorogènes sur la liaison transitoire à une protéine fluorogène-activante7,8 et la liaison programmable-unbinding des oligomers d’ADN étiquetés dans la fluorescence interne totale de réflexion (TIRF) ou l’excitation de feuille de lumière9. Récemment, nous avons rapporté une stratégie d’étiquetage nouvelle et polyvalente pour SMLM10 dans laquelle précédemment rapporté rouge décalé dimeric (DII) états de bore conventionnel di-pyromethane (BODIPY) conjugués11,12,13 sont transitoirement formant et deviennent spécifiquement excités et détectés avec des longueurs d’onde rouge-décalées.

BODIPYs sont des colorants largement utilisés avec des centaines de variantes qui étiquetent spécifiquement les compartiments sous-cellulaires et les biomolécules14,15,16. En raison de leur facilité d’utilisation et de leur applicabilité dans les cellules vivantes, les variantes BODIPY sont disponibles dans le commerce pour la microscopie à fluorescence conventionnelle. Ici, nous décrivons un protocole détaillé et optimisé sur la façon dont les centaines de conjugués BODIPY disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour les CELLULES vivantes SMLM. En accordant la concentration des monomers BODIPY et en optimisant les pouvoirs laser d’excitation, les paramètres d’imagerie et d’analyse de données, les images super-résolutions de haute qualité et les données de suivi d’une seule molécule sont obtenues dans les cellules vivantes. Lorsqu’ils sont utilisés à faible concentration (25-100 nM), les conjugués BODIPY peuvent être utilisés simultanément pour SMLM dans le canal red-shifted et pour la microscopie de fluorescence conventionnelle corrélative dans le canal d’émission classique. Les données sur les molécules uniques obtenues peuvent être analysées pour quantifier l’organisation spatiale des structures immobiles et pour extraire les états diffusifs des molécules dans les cellules vivantes17. La disponibilité des sondes BODIPY sous forme verte et rouge permet une imagerie multicolore lorsqu’elle est utilisée dans la bonne combinaison avec d’autres fluorophores compatibles.

Dans ce rapport, nous fournissons un protocole optimisé pour l’acquisition et l’analyse des données SMLM à cellules vivantes à l’aide de BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rouge et lysotracker-vert en plusieurs couleurs. Nous résolvons les acides gras et les lipides neutres dans les cellules vivantes de levure et de mammifères avec la résolution de nm de 30 nm. Nous démontrons en outre que les cellules de levure régulent la distribution spatiale des acides gras ajoutés à l’extérieur en fonction de leur état métabolique. Nous constatons que les acides gras BODIPY ajoutés (FA) se localisent au réticulum endoplasmique (ER) et aux gouttelettes lipidiques (LD) dans des conditions alimentées tandis que les BODIPY-FAs forment des grappes non LD dans la membrane plasmatique au jeûne. Nous étendons davantage l’application de cette technique aux lysosomes et LD d’image dans les cellules vivantes de mammifères. Notre protocole optimisé pour SMLM utilisant les conjugués conventionnels de BODIPY peut être une ressource utile pour étudier des processus biologiques à l’échelle nanométrique avec la myriade de conjugués BODIPY disponibles.

Protocol

REMARQUE: Pour le clonage de levure et le marquage endogène s’il vous plaît se référer à notre publication récente10. 1. Préparation d’échantillons de cellules de levure pour l’imagerie Préparer une culture liquide du jour au lendemain d’une souche de levure w303. À l’aide d’un bâton en bois stérile, apercevrez une petite quantité de cellules de levure d’une plaque d’agar contenant de l’extrait de levure-peptone-dextrose dans un …

Representative Results

Ici, nous présentons une procédure optimisée de préparation d’échantillons, d’acquisition et d’analyse de données pour SMLM à l’aide de conjugués BODIPY basés sur le protocole ci-dessus(figure 1A). Pour montrer un exemple du flux de travail pour l’acquisition et l’analyse des données SMLM, nous employons BODIPY (493/503) dans la levure pour résoudre les LD en dessous de la limite de diffraction optique(figure 1B-F). Des ex…

Discussion

Dans ce protocole, nous avons démontré comment les conjugués conventionnels DE BODIPY peuvent être utilisés pour obtenir des images SMLM avec un ordre d’amélioration de grandeur dans la résolution spatiale. Cette méthode est basée sur l’exploitation précédemment rapportée, rouge-décalé DII états des colorants conventionnels BODIPY, qui se forment transitoirement par des rencontres bi-moléculaires. Ces états peuvent être spécifiquement excités et détectés avec des longueurs d’onde re…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R21GM127965.

Materials

BODIPY C12 ThermoFisher D3822 Green fatty acid analog
BODIPY C12 Red ThermoFisher D3835 Red fatty acid analog
BODIPY(493/503) ThermoFisher D3922 Neutral lipid marker
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2010 Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base US Biological D9515 Amino acids for SCD
Dextrose Sigma-Aldrich G7021 Carbon source for SCD
Eight Well Cellvis C8-1.58-N Chambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek II Sigma-Aldrich Chambered Coverglasses
ET525/50 Chroma Bandpass filter
ET595/50 Chroma Bandpass filter
ET610/75 Chroma Bandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 Serum
FF652 Semrock Beam splitter
FF731/137 Semrock Bandpass filter
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 Cell culture medium
Hal4000 Zhuang Lab, Harvard University Data acquisition software
Ixon89Ultra DU-897U Andor EMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nm CW-OBIS Lasers for excitation
Insight3 Zhuang Lab, Harvard University Single molecule localization software
L-Glutamine Gibco 25030-081 Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solution ThermoFisher A14291DJ Imaging buffer
Lysotracker Green ThermoFisher L7526 Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A Nikon Oil immersion objective
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotics
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Supplement for cell culture
T562lpxr Chroma Beam splitter
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Dissociation of adherent cell
W303 MATa strain Horizon-Dharmacon YSC1058 Parental yeast strain
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y1250 Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdc Chroma Quadband dichroic mirror

Referanslar

  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  4. Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), 4077 (2015).
  5. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  6. Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
  7. Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
  8. Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
  9. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  10. Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  11. Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
  12. Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2′-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
  13. Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
  14. Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
  15. Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
  16. Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
  17. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
  18. Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
  19. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Biyoinformatik. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  20. Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
  21. Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  22. Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
  23. Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
  24. Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
  25. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
  26. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  27. Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Adhikari, S., Banerjee, C., Moscatelli, J., Puchner, E. M. Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking. J. Vis. Exp. (160), e60950, doi:10.3791/60950 (2020).

View Video