A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Yi Zhang; Kanako Kurosawa; Daisuke Nishiura; Mika Tei; Mikiko Tsudome

doi:10.3791/60945

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Kimya

Tek DNA Moleküllerinden Kitlesel Paralel Protein Sentezi için Femtolitre Damlacık Dizisi

Published: June 20, 2020

doi:

10.3791/60945

Yi Zhang¹, Kanako Kurosawa¹, Daisuke Nishiura², Mika Tei¹, Mikiko Tsudome³

¹SUGAR Program, X-star,Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), ²Center for Mathematical Science and Advanced Technology,Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), ³Deep-Sea Nanoscience Research Group,Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

Özet

Protokolün genel amacı, hücre içermeyen protein sentezi için kullanılabilecek 1 cm² düzlemsel substrat üzerinde bir milyondan fazla sipariş, üniforma, kararlı ve biyouyumlu femtolitre damlacıkları hazırlamaktır.

Abstract

Bilimsel enstrümantasyonun mekansal çözünürlük ve algılama duyarlılığındaki gelişmeler, biyolojik ve kimyasal araştırmalar için küçük reaktörlerin uygulanmasını mümkün kılabilir. Yüksek performanslı mikroreaktörlere olan talebi karşılamak için femtolitre damlacık dizisi (FemDA) cihazı geliştirdik ve büyük ölçüde paralel hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarında uygulamaya örnek verdik. Bir milyondan fazla tek tip damlacık, iki aşamalı bir yağ sızdırmazlık protokolü kullanılarak parmak büyüklüğünde bir alanda kolayca üretildi. Her damlacık hidrofilik bir alt ve hidrofobik bir yanak oluşan bir femtolitre mikrohazna demirledi. Hibrit hidrofilik-in-hidrofobik yapısı ve özel sızdırmazlık yağları ve yüzey aktif maddeler buharlaşma kaybı olmadan femtolitre uzayda femtolitre sulu çözeltisi stably istinat için çok önemlidir. Femtolitre konfigürasyonu ve FemDA cihazının basit yapısı minimum reaktif tüketimine olanak sağladı. Damlacık reaktörlerinin tek düze boyutu, büyük ölçekli nicel ve zaman-kurs ölçümleri ikna edici ve güvenilir yaptı. FemDA teknolojisi CFPS reaksiyonunun protein verimini her damlacıktaki DNA moleküllerinin sayısıyla ilişkilendirdi. Cihazın mikro imalatı, femtolitre damlacıklarının oluşumu ve mikroskobik görüntü verilerinin elde edilmesi ve analizi ile ilgili prosedürleri kolaylaştırdık. Optimize edilmiş düşük çalışma maliyeti ile ayrıntılı protokol FemDA teknolojisi standart temiz oda tesisleri ve kendi yerinde geleneksel floresan mikroskop olan herkes için erişilebilir hale getirir.

Introduction

Araştırmacılar biyo/kimyasal reaksiyonları gerçekleştirmek için reaktörleri kullanırlar. Reaktörün boyutunu küçültmek ve iş verimliliğini artırırken reaktif tüketimini azaltmak için deneysel verimi artırmak için önemli çabalar gösterilmiştir. Her iki açıdan da araştırmacıları ağır bir iş yükünden kurtarmayı, maliyeti azaltmayı ve araştırma ve geliştirmeyi hızlandırmayı amaçlamaktadır. Reaktör teknolojilerinin gelişimi hakkında reaksiyon hacimleri ve iş hacmi açısından net bir tarihsel yol haritası var: tek beaers / şişe / test tüpleri, mililitre tüpler, mikrolitre tüpler, mikrolitre 8-tüp şeritler, mikrolitre 96/384/1536-iyi plaka, ve mikroakışkan nanolitre / picoliter /femtolitre reaktörler¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶⁶^. Son yıllarda yarı iletken endüstrisinde ki entegre devre yongalarındaki transistörlerin özellik boyutunu küçültmeye benzer şekilde, biyo/kimyasal mikroreaktörler hacim azaltma ve sistem entegrasyonundan geçmaktadır. Bu tür küçük ölçekli araçlar hücre tabanlı veya hücresiz sentetik biyoloji, biyoüretim ve yüksek iş letibine prototipleme ve tarama^8,⁹^,^,¹⁰^,¹¹^,¹²üzerinde derin bir etkisi olmuştur. Bu yazı benzersiz bir damlacık dizi teknolojisinin geliştirilmesi bizim son çaba açıklar ve CFPS^13,sentetik biyoloji ve moleküler tarama toplulukları için temel bir teknoloji¹⁴onun uygulama göstermektedir. Özellikle, FemDA cihazını herkes için erişilebilir hale getirmek için kasıtlı olarak optimize edilmiş ve düşük maliyetli bir protokol salıyoruz. Minyatürleştirilmiş cihaz için düşük maliyetli ve kullanımı kolay protokol üniversitelerin eğitim amaçlarına katkıda bulunacak ve teknolojinin yayılmasına yardımcı olacaktır.

FemDA, efemtolitre damlacıklarını 1^cm 2’de 10^6’lık ultra yüksek yoğunlukta düzlemsel cam bir yüzey üzerinde hazırlar. Biz bir hidrofobik polimer kaplı, CYTOP¹⁵, cam substrat ve seçici kazınmış (kaldırıldı) CYTOP önceden tanımlanmış pozisyonlarda substrat üzerinde bir mikrooda dizi oluşturmak için. Böylece, ortaya çıkan mikrohazon hidrofobik yanak (CYTOP) ve hidrofilik alt (cam) oluşur. Sırayla desenli yüzey üzerinde su ve yağ akan zaman, su sıkışmış ve mikroodaları içine mühürlü olabilir. Hidrofilik-in-hidrofobik yapı mikroodaları dışında su püskürtmeiçin hayati önem taşımaktadır, bireysel mikroreaktörler izole, ve femtolitre alanı içinde küçük bir sulu çözüm istinat. Benzersiz özelliği başarıyla su-in-oil damlacıkları ve lipid bilayer mikrobölmeleri^16,^,¹⁷hazırlanması için uygulanmıştır. Prototip cihaz¹⁶ile karşılaştırıldığında, ilk cytop polimer tam bir kaldırma yanı sıra cam alt tam bir pozlama gerçekleştirmek için mikroüretim süreci optimize. CYTOP, cam, plastik ve silikon gibi geleneksel mikroreaktör malzemelerinden son derece düşük yüzey gerilimine (19 mN/m) daha düşük olan özel bir floropolimerdir. Onun iyi optik, elektrik, ve kimyasal performans zaten mikroakışkan cihazların yüzey tedavisinde kullanılmıştır¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹,²²^,^,²³^,²⁴. FemDA sisteminde, CYTOP yüzeyinde yağIyi ıslatma elde etmek için, yağ yüzey gerilimi katı yüzey²⁵daha düşük olmalıdır. Aksi takdirde, katı yüzeyle temas eden sıvı yağ, yüzeye yayılmak yerine küresel olma eğilimindedir. Ayrıca, bazı popüler perflorokarbon yağlarının (örneğin, 3M FC-40)¹⁶ ve hidrofloroether yağlarının (örneğin, 3M Novec serisi) CYTOP’un amorf morfolojisi sonucunda CYTOP’u eritebileceğini ve damlacıklar arasında çapraz kontaminasyon açısından şüpheli olduğunu bulduk. Neyse ki, daha düşük (< 19 mN/m) yüzey gerilimi sergileyen biyouyumlu ve çevre dostu bir yağ tespit ettik¹³. Biz de düşük konsantrasyonda seçilen yağ ve fonksiyon çözünebilir yeni bir yüzey aktif bulundu (0.1%, en az 10 kat daha önce bildirilen popüler olanlar²⁶^,²⁷)¹³. Ortaya çıkan su/yağ arabirimi yüzey aktif madde ile stabilize edilebilir. Yağın yüksek buharlaşma oranı nedeniyle, yağ ile floş aşağıdaki, biz mikrochambers mühür ilk yerine başka bir biyouyumlu ve çevre dostu yağ uygulanır. İlk yağa (ASAHIKLIN AE-3000 % 0,1 wt SURFLON S-386) “floş yağı” ve ikinci yağı (Fomblin Y25) sırasıyla “sızdırmazlık yağı” diyoruz.

İki aşamalı yağ sızdırmazlık stratejisi, femtolitre damlacık dizisinin birkaç dakika içinde ve sofistike enstrümantasyon olmadan sağlam bir oluşumunu gerçekleştirebilir. Buharlaşma sorunu nedeniyle, pikolitre hacimleri²⁸daha küçük mikroreaktörler oluşturmak için zor kabul edilmiştir. FemDA bu sorunu mikroreaktörlerin/damlacıkların hazırlanmasında kullanılan malzeme ve prosesleri sistematik olarak optimize ederek ele aldı. Elde edilen damlacıkların dikkat çekici birçok özelliği arasında femtolitre ölçeğinde yüksek tekdüzelik (veya monodispersite), stabilite ve biyouyumluluk sayılabilir. Damlacık hacminin varyasyon katsayısı (CV) sadece %3’tür (mikroskobik görüntüler için vinyet düzeltmesi yapılmadan), dünyadaki damlacık platformları arasında en küçük CV’dir ve bu da son derece paralel ve nicel bir ölçüm sağlar. Femtolitre damlacık, oda sıcaklığındaki damlacıklar arasında çapraz kontaminasyon olmadan en az 24 saat stabildir ve bu da güvenilir bir zaman dilimi ölçümü için değerlidir. Biyouyumluluk ile ilgili olarak, biz daha önce zor veya verimsiz²⁹^,³⁰olarak kabul edilmişti femtolitre damlacık, tek kopya şablon DNA çeşitli proteinler sentezleyerek başardı. FemDA’da sentezlenebilen bazı proteinlerin neden diğer damlacık sistemlerinde sentezlenemediğini açıklığa kavuşturmaya değer. FemDA sadece teknik bir ilerleme değildi, aynı zamanda protein verimini (damlacık floresan yoğunluğu tarafından yansıttığı gibi) her damlacıktaki şablon DNA moleküllerinin sayısıyla ilişkilendirebilen eşi görülmemiş nicel bir ölçüm gerçekleştirdi. Sonuç olarak, FemDA tabanlı CFPS damlacıkların floresan yoğunluğunun histogramı, eşit pik-tepe aralıklarında Gauss’un dağılımlarının toplamı ile güzelce monte edilebilen ayrı bir dağılım gösterdi. Ayrıca, farklı sayıda DNA molekülü içeren damlacıkların oluşma olasılığı Poisson dağılımı^31’emükemmel bir uyum du. Böylece, her damlacık farklı protein verimi ayrık dağılımına göre normalize edilebilir. Bu kritik özellik, enzimatik aktivite bilgilerini henüz diğer mikroreaktör platformlarında bulunmayan görünür yoğunluktan ayırmamızı sağlar. Mevcut mikroakışkan hücre / damlacık sıralama sistemleri tam otomatik sıralama ve iyi konsantre örnekleri yetenekli ama bazen sadece analitik açıdan nispeten geniş veya uzun kuyruklu histogram çıktı olabilir³²^,³³. Son derece nicel ve biyouyumlu FemDA sistemimiz mikroreaktör geliştirme alanında yeni bir kriter ve yüksek analitik standart belirlemez.

Damlacıkların hazırlanmasında kullanılabilecek yağlar ve yüzey aktif maddeler hala çok sınırlıdır³⁴. FEmDA’da kurulan ASAHIKLIN AE-3000 ve SURFLON S-386 kombinasyonu sulu faz ve petrol^{fazı 13}arasındaki fizyokimyasal arayüzün büyüyen cephaneliğinin yeni bir üyesidir. FemDA yeni arayüzü fiziksel olarak kararlı, kimyasal olarak durağan ve biyolojik olarak karmaşık transkripsiyon, çeviri ve proteinlerin birçok tür için post-çevirisel modifikasyon makine ile^{uyumludur 13}. Bunun yerine damlacık ayarlarında sentezlenemeyen bir protein bulmak oldukça cazip olacaktır. Ayrıca, reaktiflerin maliyet tasarrufu daha nanolitre ve pikolitre reaktör sistemlerinde daha femtolitre damlacık sistemi daha belirgindir³⁵^,³⁶. Özellikle, genellikle mikroakışkan damlacık üretim sistemlerinde, ama bizim FemDA esas olarak tüp veya dış malzemeleri neden olduğu büyük bir ölü hacim olurdu. Dizi biçimi aynı zamanda her bir reaktör³⁷için tekrarlanan ve ayrıntılı mikroskobik karakterizasyon (sözde yüksek içerik analizine benzer) tarafından tercih edilir, hızlı hareket eden bir nesne için sadece tek bir anlık görüntü yerine. Femtolitre ölçeği, bir milyondan fazla reaktörün parmak büyüklüğünde bir alana entegrasyonunu sağlarken, aynı sayıda nanolitre reaktör (varsa) metrekare nin üzerinde bir alan gerektirmesine neden oldu ve bu sistem için hiç şüphesiz pratik olmayacaktır.

Protocol

1. Femtolitre mikrohazasyon dizisi substratının mikroimalatı NOT: Aşağıdaki mikro üretim deneyini bir temiz odada gerçekleştirin. Temiz odaya girmeden önce eldiven ve temiz oda kıyafeti giyin. Temizleme kapağı cam substrat Kapak camı bir kapak cam boyama rafına yerleştirin. Kapak camı 8 M sodyum hidroksit (NaOH) içinde 15 dakika oda sıcaklığında (RT) sonicate.DİkKAT: Yüksek konsantrasyonlarda NaOH cilt ve göz için son derece tehlikelidir. Herhang…

Representative Results

Mikrofabrikasyon işlemi substrat temizliği, yüzey işlevselleştirmesi, CYTOP kaplama, fotolitografi, kuru gravür, fotodirenç sıyırma ve son temizlikten oluşmaktadır. Daha da önemlisi, sunulan protokol, standart kapaklı cam yüzey üzerinde son derece paralel hidrofilik-in-hidrofobik bir yapı üreten mikrochambers Şekil 3Aiçinde hidrofobik CYTOP polimerin tamamen çıkarılmasına olanak sağlamıştır. Yağ sızdırmazlık protokolü yardımıyla, ortaya çıkan damlacıklar?…

Discussion

FemDA’daki son derece düzgün, kararlı ve biyouyumlu damlacıkları temel alan son derece nicel ölçüm, çalışmamızın diğerlerinden farklı benzersiz özelliği olan ayrık dağılımı sağladı. Bu yazıda mikrofabrikasyon ve damlacık oluşum süreçlerini sistematik olarak optimize ettik ve ayrıntılı olarak anlattık. Kurulan protokolde birkaç kritik adım vardır.

İlk olarak, dikdörtgen ince cam alt tabaka üzerinde son derece viskoz CYTOP polimer düzgün kaplama büyük ?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma JSPS KAKENHI hibe numarası JP18K14260 ve Japonya Ajansı Deniz-Dünya Bilim ve Teknoloji için bütçe tarafından desteklenmiştir. Biz shigeru Deguchi (JAMSTEC) ve Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) karakterizasyon tesisleri sağlamak için teşekkür ederiz. Ken Takai’ye (JAMSTEC) ticari yazılım desteği için teşekkür ederiz. Mikro fabrikasyon, Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı ‘Nanoteknoloji Platform Programı (MEXT), Japonya, Grant Number JPMXP09F19UT0087 tarafından desteklenen Tokyo Üniversitesi Takeda Sentanchi Supercleanroom’da gerçekleştirilmiştir.

Materials

(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
1 mL syringe	Terumo	SS-01T
2-propanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope	Lasertec	OPTELICS HYBRID	Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe	Terumo	SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate	Thermo Fisher Scientific	D6567	Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.8%.
Air blower	Hozan	Z-263
Aluminum block	BIO-BIK	AB-24M-02
Aluminum microtube stand	BIO-BIK	AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper	Ozu	028208
Biopsy punch with plunger	Kai	BPP-10F
Cover glass	Matsunami Glass	No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness)	Size-customized.
Cover glass staining rack	Nakayama	803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper	Nippon Paper Crecia	C100-M
Cutting mat	GE Healthcare	WB100020
CYTOP	AGC	CTL-816AP
Deaeration mixer	Thinky	AR-100
Desktop cutter	Roland	STIKA SV-8
Developer	AZ Electronic Materials	AZ 300 MIF	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape	Teraoka Seisakusho	7602 #25
Ethanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.5%.
Fiji			Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter	Tokyo-IDEAL	MT-0100
Fomblin oil	Solvay	Y25, or Y25/6	Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate	AS ONE	TH-900
Injection needle	Terumo	NN-2270C	22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti-E	Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph	Synergy		Version: 4.5
Mask aligner	SUSS	MA-6	Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette	GILSON	E M250E	Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel	Microsoft		Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber	AS ONE	MVP-100MV
Nuclease-free water	NIPPON GENE	316-90101
Parafilm	Amcor	PM-996
PCR tube	NIPPON Genetics	FG-021D/SP
Petri dish	AS ONE	GD90-15	Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist	AZ Electronic Materials	AZ P4903	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader	BioTek	POWERSCAN HT
Polyethelene gloves	AS ONE	6-896-02	Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit	New England Biolabs	E6800S or E6800L	For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system	Samco	RIE-10NR	Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor	New England Biolabs	M0314S
Scotch tape	3M	810-1-18D
Sodium hydroxide solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	194-09575	8 M concentration; danger.
Spin coater	Oshigane	SC-308
SURFLON S-386 surfactant	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer	Dow	Sylgard184	Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers	Ideal-tek	2WF.SA.1 2A
Ultrasonic cleaner	AS ONE	ASU-2M
Vacuum chuck	Oshigane	(Customized)	Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

Referanslar

Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
Zhang, Y., Jiang, X., Fan, C. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. , 113-153 (2013).
Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C., Conn, P. M. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. , 143-162 (2010).
Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
Gonzalez, R. C., Woods, R. E. . Digital image processing. , (2018).
Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).

Etiketler

Femtoliter Droplet Array Single DNA Molecules Parallel Protein Synthesis Enzyme Activity Measurement Microfabrication Photolithography CYTOP Polymer Spin Coating Reactive-ion Etching

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).