단일 DNA 분자에서 대규모 병렬 단백질 합성을 위한 펨토리터 물방울 배열

연구원은 바이오/화학 반응을 수행하기 위해 반응기를 사용합니다. 원자로의 크기를 줄이고 시약 소비를 낮추면서 작업 효율을 높이기 위해 실험 처리량을 늘리기 위한 상당한 노력이 이루어지고 있습니다. 두 측면 모두 연구원들을 무거운 작업부하에서 해방시키고 비용을 절감하며 연구 개발 속도를 높이는 것을 목표로 합니다. 우리는 반응 량과 처리량의 관점에서 원자로 기술의 개발에 대한 명확한 역사적 로드맵을 가지고 : 단일 비커 / 플라스크 / 테스트 튜브, 밀리리터 튜브, 마이크로리터 튜브, 마이크로리터 8튜브 스트립, 마이크로리터 96/384/1536웰 플레이트, 미세유체 나노리터/피콜리터/펨톨리터 반응기^{1,,2,,3,,4,,5,6,7.,7} 지난 수십 년 동안 반도체 산업의 집적 회로 칩에 트랜지스터의 특징 크기를 축소하는 유사, 바이오 / 화학 마이크로 반응기는 볼륨 감소 및 시스템 통합을 겪고있다. 이러한 소규모 도구는 세포 기반 또는 세포가 없는 합성 생물학, 바이오 제조 및 고처리량 프로토타이핑 및 스크리닝^{8,9,9,10,,11,,12에}지대한 영향을 미쳤다. 이 논문은 독특한 물방울 어레이 기술 개발에 대한 최근의 노력을 설명하고 합성 생물학 및 분자 선별 커뮤니티^14의기본 기술인 CFPS^13에서의 적용을 보여줍니다. 특히, 우리는 의도적으로 모든 사람이 FemDA 장치에 액세스 할 수 있도록 최적화된 저비용 프로토콜을 제공합니다. 소형 화된 장치에 대한 저렴한 비용과 취급하기 쉬운 프로토콜은 대학의 교육 목적에 기여하고 기술을 전파하는 데 도움이 될 것입니다.

FemDA는 평면 유리 기판에 1cm² 당 10^6의 초고밀도에서 펨토리터 방울을 준비합니다. 우리는 기판상에 마이크로 챔버 어레이를 생성하기 위해 미리 정의된 위치에서 유리 기판에 소수성 폴리머, CYTOP^15를코팅하고 선택적으로 에칭 (제거) CYTOP. 따라서, 생성된 마이크로챔버는 소수성 측벽(CYTOP) 및 친성 바닥(glass)으로 구성된다. 패턴 표면 위로 물과 기름이 순차적으로 흐르면 물을 밀고 마이크로 챔버로 밀봉 할 수 있습니다. 소수성 소수성 구조는 마이크로 챔버 외부의 물을 격퇴하고, 개별 미세 반응기를 격리하고, 펨톨리터 공간 내부에 작은 수성 용액을 유지하는 데 필수적입니다. 독특한 성질은 수유 물방울과 지질 이중층 마이크로컴파트먼트^16,,17의제조를 성공적으로 위해 적용되었다. 프로토타입^{장치(16)에}비해, 먼저 CYTOP 폴리머의 완전한 제거뿐만 아니라 유리 바닥의 완전한 노출을 실현하기 위해 미세 제조 공정을 최적화했습니다. CYTOP은 유리, 플라스틱 및 실리콘과 같은 기존 미세 반응기 재료보다 표면 장력 (19 mN /m)보다 낮은 특수 불소 폴리머입니다. 그것의 좋은 광학, 전기 및 화학 적 성능은 이미 미세 유체 장치^{(18,19,,20,,21,22, 22,,,,23,,24)의}표면 처리에 활용되었다. FemDA 시스템에서는 CYTOP 표면에서 오일의 좋은 습윤을 달성하기 위해 오일의 표면 장력은 고체^{표면(25)보다}낮아야 한다. 그렇지 않으면, 고체 표면과 접촉하는 액체 오일은 표면 위로 퍼지기보다는 구형이 되는 경향이 있다. 게다가, 우리는 몇몇 대중적인 퍼플루오로카본 오일 (예를 들면, 3M FC-40)¹⁶ 및 하이드로 플루오로에테르 오일 (예를 들면, 3M Novec 시리즈)는 정량측정에 치명적이고 방울 중 교차 오염의 관점에서 의심할 것이다 CYTOP의 비정질 형태결과로 CYTOP를 용해할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 다행히도, 우리는 낮은 (&19 mN/m) 표면 장력^13을전시하는 생체 적합성 및 환경 친화적 인 오일을 확인했습니다. 또한 선택된 오일및 기능에 용해할 수 있는 새로운 계면활성제를 보다 낮은 농도(0.1%, 적어도 10배 이상 낮은 것으로 보고된 인기 대상자^26,,27)13을발견했다. 그 결과 물/오일 인터페이스는 계면활성제에 의해 안정화될 수 있다. 오일의 높은 증발 속도 때문에, 오일플러시에 이어, 우리는 마이크로 챔버를 밀봉하는 첫 번째 오일을 대체하기 위해 또 다른 생체 적합성 및 환경 친화적 인 오일을 적용했다. 우리는 첫 번째 오일 (ASAHIKLIN AE-3000 와 0.1 wt % SURFLON S-386) “플러시 오일”과 두 번째 오일 (Fomblin Y25)을 각각 “밀봉 오일”이라고 부릅니다.

2단계 오일 밀봉 전략은 정교한 계측 없이 몇 분 안에 펨토리터 액적 배열의 견고한 형성을 실현할 수 있습니다. 증발 문제로 인해 피콜리터^{부피(28)보다}작은 미세 반응기를 생성하는 것이 어려운 것으로 간주되고 있다. FemDA는 미세 반응기/물방울 의 제조에 사용되는 재료와 공정을 체계적으로 최적화하여 이 문제를 해결했습니다. 결과 물방울의 몇 가지 주목할 만한 특징은 높은 균일성 (또는 단백성), 안정성 및 펨토리터 척도에서 생체 적합성을 포함한다. 액적 볼륨의 변형 계수(CV)는 3%에 불과하며(미세한 이미지에 대한 비네팅 보정 없이), 세계에서 가장 작은 CV로, 이는 매우 병렬 및 정량적 측정을 보장합니다. 펨토리터 액적은 실온의 방울 중 교차 오염 없이 최소 24시간 동안 안정적이며, 이는 신뢰할 수 있는 타임코스 측정에 유용합니다. 생체 적합성에 관해서는, 이전에 어렵거나^{비효율적인,}것으로 여겨졌던 펨토리터 액적물에서 단일 복사 템플릿 DNA로부터 다양한 단백질을 합성하는 데^{성공했다.} 왜 FemDA에서 합성 될 수 있는 몇몇 단백질이 그밖 물방울 시스템에서 합성될 수 없는지 해명할 가치가 있을 것입니다. FemDA는 단순히 기술적 진보가 아니라 단백질 수율(액적의 형광 강도에 의해 반영되는)을 각 액적의 템플릿 DNA 분자 수와 연관시킬 수 있는 전례 없는 정량적 측정을 실현했습니다. 그 결과, FemDA 기반 CFPS의 형벌 강도의 히스토그램은 동일한 피크-투-피크 간격의 가우시안 분포의 합계에 의해 멋지게 장착될 수 있는 이산 분포를 보였다. 더욱이, DNA 분자의 상이한 수를 포함하는 물방울의 발생 확률은 푸아송^{분포(31)에}딱 맞다. 따라서, 각 액적에서 상이한 단백질 수율은 이산 분포에 기초하여 정규화될 수 있다. 이 중요한 기능을 사용하면 효소 활동 정보를 다른 미세 반응기 플랫폼과 함께 사용할 수 없었던 명백한 강도와 분리할 수 있습니다. 기존 미세 유체 세포/물방울 선별 시스템은 완전 자동 정렬에 능숙하며 시료 집중에 능숙하지만 때로는 분석 양면^32,,33에서비교적 광범위하거나 긴 꼬리 히스토그램만 출력할 수 있습니다. 당사의 고정정성 및 생체 적합성 FemDA 시스템은 미세 반응기 개발 분야에서 새로운 벤치마크와 높은 분석 표준을 설정합니다.

물방울의 제조에 사용할 수있는 오일과 계면 활성제는 여전히 매우 제한되어^{있습니다 34.} FemDA에 설립된 ASAHIKLIN AE-3000과 SURFLON S-386의 조합은 수성 상과 오일 상^13단계사이의 물리화학 적 인터페이스의 성장 무기고의 새로운 멤버이다. FemDA의 새로운 인터페이스는 물리적으로 안정적이고 화학적으로 불활성이며, 많은 종류의 단백질을 위한 복잡한 전사, 번역 및 번역 후 수정 기계와 생물학적으로 호환된다^13. 대신 액적 설정에서 합성 할 수없는 단백질을 찾는 것이 오히려 매력적일 것입니다. 게다가, 시약의 비용 절감은 나노 리터 및 피콜리터 원자로 시스템^35,,36보다펨톨리터 액적 시스템에서 더 분명하다. 특히, 주로 튜브 또는 외부 공급에 의해 발생 되는 큰 죽은 볼륨이 있을 것 이다, 미세 유체 방울 생성 시스템에 하지만 우리의 FemDA에. 어레이 형식은 빠르게 움직이는 오브젝트에 대한 단일 스냅숏이 아니라 모든 단일^{반응기(37)에}대해 반복적이고 상세한 현미경 특성화(소위 고함량 분석과 유사)에 의해 선호됩니다. 펨토리터 스케일은 손가락 크기의 영역에 100만 개 이상의 원자로를 통합할 수 있었으며, 동일한 수의 나노리터 원자로(존재하는 경우)는 평방 미터 면적에 필요하며, 이는 의심할 여지 없이 이러한 시스템을 제조하거나 사용하는 것이 비실용적일 것입니다.