Un array di gocciole del femtolitro per sintesi proteica massicciamente parallela da molecole di DNA singolo

I ricercatori utilizzano i reattori per eseguire reazioni biochimiche. Ci sono sforzi significativi che sono stati fatti per ridurre le dimensioni del reattore e aumentare la produttività sperimentale al fine di ridurre il consumo di reagente migliorando al contempo l’efficienza del lavoro. Entrambi gli aspetti mirano a liberare i ricercatori da un carico di lavoro pesante, riducendo i costi e accelerando la ricerca e lo sviluppo. Abbiamo una chiara tabella di marcia storica sullo sviluppo delle tecnologie dei reattori dal punto di vista dei volumi di reazione e della produttività: singoli becher/flask/test-tube, tubi milliliter, tubi microliter, nanotubi microliter 8 tubi, microliter 96/384/1536-bene piastra, e reattori microfluidici nanoliter/picoliter/picoliter/1^{1,2,3,4,5,6,7}. Analogo al ridimensionamento delle dimensioni delle caratteristiche dei transistor sui chip di circuito integrati nell’industria dei semiconduttori negli ultimi decenni, i microreattori bio/chimici stanno attraversando la riduzione del volume e l’integrazione del sistema. Tali strumenti su piccola scala hanno avuto un profondo impatto sulla biologia sintetica basata su cellule o senza cellule, sulla bioproduzione e sulla prototipazione e lo screening ad alta produttività^8,9,10^,1111,12. Questo documento descrive il nostro recente sforzo sullo sviluppo di una tecnologia unica di array di gocciolini e dimostra la sua applicazione in CFPS¹³, una tecnologia fondamentale per la biologia sintetica e le comunità di screening molecolare¹⁴. In particolare, forniamo intenzionalmente un protocollo ottimizzato e a basso costo per rendere il dispositivo FemDA accessibile a tutti. Il protocollo a basso costo e facile da gestire per il dispositivo miniaturizzato contribuirebbe agli scopi educativi delle università e contribuirebbe a diffondere la tecnologia.

FemDA prepara le goccioline di femtoter ad una densità ultraelevata di 10⁶ per 1 cm² su un substrato di vetro planare. Abbiamo rivestito un polimero idrofobico, CYTOP¹⁵, sul substrato di vetro e inciso selettivamente (rimosso) CYTOP in posizioni predefinite per generare un array a microcamera sul substrato. Così, la microcamera risultante è composta da una parete laterale idrofobica (CYTOP) e un fondo idrofilo (vetro). Quando scorre in sequenza acqua e olio sulla superficie modellata, l’acqua può essere intrappolata e sigillata nelle microcamere. La struttura idrofila-in-idrofobica è vitale per respingere l’acqua al di fuori delle microcamere, isolare i singoli microreattori e mantenere una piccola soluzione acquosa all’interno dello spazio femtolitro. La proprietà unica è stata applicata con successo per la preparazione di goccioline acqua-in-olio e lipidi bistrato microcomogni^16,17. Rispetto al prototipo del dispositivo^16,abbiamo prima ottimizzato il processo di microfabbricazione per realizzare una rimozione completa del polimero CYTOP e una completa esposizione del fondo di vetro. CYTOP è un fluoropolimero speciale con una tensione superficiale estremamente bassa (19 mN/m) inferiore a quella dei materiali convenzionali di microreattore come vetro, plastica e silicone. Le sue buone prestazioni ottiche, elettriche e chimiche sono già state utilizzate nel trattamento superficiale di dispositivi microfluidici^{18,19,20,21,22,23,24}. Nel sistema FemDA, per ottenere una buona bagnatura dell’olio sulla superficie CYTOP, la tensione superficiale dell’olio deve essere inferiore a quella della superficie solida²⁵. In caso contrario, l’olio liquido a contatto con la superficie solida tende a diventare sferico piuttosto che diffondersi sulla superficie. Inoltre, abbiamo scoperto che alcuni oli di perfluorocarburi popolari (ad esempio, 3M FC-40)¹⁶ e oli idrofluoroetering (ad esempio, serie 3M Novec) possono sciogliere CYTOP a causa della morfologia amorfo di CYTOP, che è fatale per la misurazione quantitativa e sarebbe discutibile in termini di contaminazione incrociata tra le goccioline. Fortunatamente, abbiamo identificato un olio biocompatibile ed ecologico che mostra una tensione superficiale inferiore (< 19 mN/m)¹³. Abbiamo anche trovato un nuovo surfactant che può sciogliere nell’olio selezionato e funzionare in una bassa concentrazione (0.1%, almeno 10 volte inferiore a quelli precedentemente segnalati popolari^26,27)¹³. L’interfaccia acqua/olio risultante può essere stabilizzata dal surfactant. A causa dell’elevato tasso di evaporazione dell’olio, seguendo il filo con l’olio, abbiamo applicato un altro olio biocompatibile e rispettoso dell’ambiente per sostituire il primo a sigillare le microcamere. Chiamiamo il primo olio (ASAHIKLIN AE-3000 con 0,1 wt % SURFLON S-386) il “olio a filo” e il secondo olio (Fomblin Y25) l'”olio di sgelazione”, rispettivamente.

La strategia di sigillamento dell’olio in due fasi può realizzare una solida formazione dell’array di goccioline femtoliter in pochi minuti e senza strumentazione sofisticata. A causa del problema dell’evaporazione, è stato considerato difficile generare microreattori più piccoli dei volumi di picoliter²⁸. FemDA ha affrontato questo problema ottimizzando sistematicamente i materiali e i processi utilizzati per la preparazione di microreattori/goccioline. Diverse caratteristiche degne di nota delle goccioline risultanti includono l’alta uniformità (o monodispersità), la stabilità e la biocompatibilità su scala femtolare. Il coefficiente di variazione (CV) del volume delle goccioline è solo del 3% (senza correzione della vignettatura per le immagini microscopiche), il più piccolo CV tra le piattaforme di goccioline al mondo, che garantisce una misurazione altamente parallela e quantitativa. La goccia di femtolitro è stabile per almeno 24 ore senza contaminazione incrociata tra le goccioline a temperatura ambiente, il che è prezioso per una misurazione affidabile del percorso temporale. Per quanto riguarda la biocompatibilità, siamo riusciti a sintetizzare varie proteine da un DNA modello a copia singola nella goccia femtolitro, che in precedenza era stata considerata difficile o inefficiente^29,30. Sarebbe degno di chiarire perché alcune proteine in grado di essere sintetizzate nel FemDA non possono essere sintetizzate in altri sistemi di goccioline. FemDA non era solo un avanzamento tecnico, ma ha anche realizzato una misurazione quantitativa senza precedenti in grado di correlare la resa proteica (come riflesso dall’intensità di fluorescenza della gocciolina) al numero di molecole di DNA modello in ogni goccia. Di conseguenza, l’istogramma dell’intensità di fluorescenza delle goccioline dei CFPS con sede a FemDA ha mostrato una distribuzione discreta che può essere ben montata da una somma di distribuzioni gaussiane di intervalli picco-picco uguali. Inoltre, la probabilità di comparsa di goccioline contenenti diversi numeri di molecole di DNA era perfetta per una distribuzione di Poisson³¹. Così, la diversa resa proteica in ogni goccia può essere normalizzata in base alla distribuzione discreta. Questa caratteristica critica ci permette di separare le informazioni sull’attività ezimatica dall’intensità apparente, che non è ancora disponibile con altre piattaforme di microreattore. I sistemi di smistamento microfluidici esistenti per cellule microfluidiche sono abili nello smistamento completamente automatico e sono bravi a concentrare i campioni, ma a volte possono produrre solo un istogramma relativamente ampio o a coda lunga nell’aspetto analitico^32,33. Il nostro sistema FemDA altamente quantitativo e biocompatibile stabilisce un nuovo punto di riferimento e un elevato standard analitico nel campo dello sviluppo di microreattori.

Gli oli e i surfactants che potrebbero essere utilizzati per la preparazione delle goccioline sono ancora molto limitati³⁴. La combinazione di ASAHIKLIN AE-3000 e SURFLON S-386 stabilita a FemDA è un nuovo membro del crescente arsenale dell’interfaccia fisiochimica tra la fase acquosa e la fase dell’olio^13. La nuova interfaccia in FemDA è fisicamente stabile, chimicamente inerte, e biologicamente compatibile con la trascrizione complessa, traduzione, e macchinare di modifica post-traduzione per molti tipi di proteine¹³. Sarebbe piuttosto interessante trovare una proteina che non può essere sintetizzata nelle impostazioni delle goccioline. Inoltre, il risparmio sui costi dei reagenti è più evidente nel sistema di gocciolina del femtolitro rispetto a quello dei sistemi di reattori nanoliter e picoliter^35,36. In particolare, ci sarebbe spesso un grande volume morto, che è causato principalmente da tubi o forniture esterne, nei sistemi microfluidici di generazione di gocciolini, ma non nel nostro FemDA. Il formato della matrice è favorito anche dalla caratterizzazione microscopica ripetuta e dettagliata (simile alla cosiddetta analisi ad alto contenuto) per ogni singolo reattore³⁷, piuttosto che una sola istantanea per un oggetto in rapido movimento. La scala femtobotera ha permesso l’integrazione di oltre un milione di reattori su un’area grande di un dito, mentre lo stesso numero di reattori nanollitri (se esiste) richiede un’area di metro quadrato, il che sarebbe indubbiamente poco pratico per la produzione o l’uso di tale sistema.