Özet

Geração de Oligodendrocytes e Oligodendrocyte-Conditioned Medium para Experimentos de Cocultura

Published: February 09, 2020
doi:

Özet

Aqui, apresentamos um método eficiente para a purificação de oligodendrocytes e produção de meio condicioso oligodendrocyte que pode ser usado para experimentos de cocultura.

Abstract

No sistema nervoso central, os oligodendrocytes são bem conhecidos por seu papel na mielinação de axon, que acelera a propagação de potenciais de ação através da condução saltatória. Além disso, um número crescente de relatórios sugere que os oligodendrocitos interagem com neurônios além da mielinização, notadamente através da secreção de fatores solúveis. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que permite a purificação de células de linhagem oligodendroglial de culturas células gliais também contendo astrócitos e células microgliais. O método conta com tremores noturnos a 37 °C, o que permite o desprendimento seletivo das células oligodendrólais e células microgliais, e a eliminação da microglia por adesão diferencial. Descrevemos então a cultura dos oligodendrocytes e a produção de meio climatizado pelo oligodendrocyte (OCM). Também fornecemos as cinéticas do tratamento oCM ou oligodendrocytes, além de neurônios hipocampais purificados em experimentos de cocultura, estudando interações oligodendrocyte-neurônio.

Introduction

Oligodendrocytes (OLs) são células gliais do sistema nervoso central (CNS) que geram embalagem de mielina em torno de axônios. Os OLs são originários de células precursoras de oligodendrocyte (OPCs) que proliferam dentro das zonas ventriculares do CNS embrionário e depois migram e se diferenciam em OLs totalmente maduros (ou seja, células formadoras de mielina)1. Os OPCs são abundantes durante o desenvolvimento precoce, mas também persistem no cérebro adulto, onde representam a maior população de células proliferativas2. Um único OL enshea vários axônios em seções não excitáveis (ou seja, internodes), e a borda de cada alça de mielina se conecta ao axônio formando o domínio paranodal que é crucial para as propriedades isolantes da mielina1,3. Entre os desfiles estão pequenas lacunas immielinizadas chamadas os nós de Ranvier. Esses nós são ricos em canais de sódio fechados por tensão (Nav), permitindo a regeneração e rápida propagação de potenciais de ação através da condução saltatória4. Essa interação apertada também permite o suporte à energia axonal através da captação neuronal de lactato de OLs5,6.

O amadurecimento das células de linhagem oligodendroglial e o processo de mielinação são fortemente regulados por suas interações com neurônios7. De fato, OLs e OPCs, também chamados de células NG2, expressam uma série de receptores para neurotransmissores, e podem receber entrada de neurônios excitatórios e inibitórios, permitindo que eles detectem atividade neuronal que pode desencadear sua proliferação e/ou diferenciação em células mielinantes2. Por sua vez, opcs/OLs secretam microvesicles e proteínas no espaço extracelular que sozinho ou sinergicamente mediam funções neuromodulativas e neuroprotetoras8,9,10,11,12. No entanto, os mecanismos moleculares que controlam os múltiplos modos de interações entre células de linhagem oligodendroglial e neurônios ainda não foram totalmente decifrados.

Além disso, em várias condições patológicas do CNS, os OLs são afetados principalmente, perturbando assim sua interação com os neurônios. Por exemplo, na Esclerose Múltipla (EM), a disfunção neurológica é causada pela desmistelinação focal no CNS, secundária à perda de OLs que pode levar a danos axonais e acúmulo de incapacidade relacionada. A remielinização pode ocorrer, embora insuficientemente na maioria dos casos13. O progresso na última década, devido ao desenvolvimento de imunoterapias, reduziram a taxa de recaída, mas promover a remielinização permanece até o momento uma necessidade não atendida. Como tal, uma melhor compreensão do papel, funções e influências das OLs é de particular interesse para o desenvolvimento de novas terapias para um amplo espectro de condições de CNS.

Aqui, descrevemos os métodos de purificação e cultura das OLs. Isso permite o exame preciso de mecanismos intrínsecos que regulam seu desenvolvimento e biologia. Além disso, tais culturas altamente enriquecidas de OLs permitem a produção de meio com condições de oligodendrocito (OCM), que pode ser adicionado às culturas de neurônios purificados para obter uma visão do impacto de fatores secretos do OLs na fisiologia neuronal e conectividade. Além disso, descrevemos como implementar um sistema de co-cultura in vitro onde oligodendrocitos purificados e neurônios são combinados, permitindo abordar os mecanismos que regulam (re)mielinação.

Protocol

O cuidado e o uso de ratos neste experimento estão em conformidade com políticas e diretrizes institucionais (UPMC, INSERM e Diretiva do Conselho Comunitário Europeu 86/609/CEE). O seguinte protocolo é estabelecido para uma ninhada padrão de 12 filhotes. 1. Preparação dos frascos (~5 min) NOTA: Realize as seguintes etapas no dia anterior à dissecção em um capô de fluxo laminar em condições estéreis. Cubra os frascos de 150 cm2 (T15…

Representative Results

Neste protocolo, as células de linhagem OL são purificadas das culturas gliais, sacudindo astrócitos e microglia. Pureza e exame adesivo das culturas OL podem ser avaliados por imunomanchas com marcadores gliais15. A análise da expressão de diferentes marcadores indicou que as culturas ol eram principalmente pré-OLs com 90% ± 4% das células O4+, 85% ± 7% NG2+ células, e 4,7% ± 2,1% das células PLP+, enquanto 7,2% ± 2,5%…

Discussion

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para obter culturas de linhagem oligodendroglial altamente enriquecidas a partir de culturas gliais mistas, adaptadas de um método16publicado anteriormente , e a produção subsequente de meio sedél condicionado. Esta técnica de agitação não é cara, pode ser repetida três vezes e é ideal para obter alta quantidade de OLs purificados, como células cultivadas em bottenstein-Sato (BS) meio contendo PDGFα proliferam. As células gliais são preparadas…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Rémi Ronzano por seu sábio conselho na edição de manuscritos. Este trabalho foi financiado pelo ICM, INSERM, bolsa de fundação ARSEP à NSF e preço bouvet-labruyère.

Materials

5-fluorodeoxyuridine Sigma F0503
B27 supplement ThermoFisher 17504044
D-(+)-Glucose solution Sigma G8769
DNase (Deoxyribonuclease I) Worthington LS002139
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Ethanol 100% Sigma 32221-M
Ethanol 70% VWR Chemicals 83801.360
Fetal Calf Serum ThermoFisher 10082147
L-cysteine Sigma C7352
Neurobasal ThermoFisher 21103049
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium ThermoFisher A1285601
Polyethylenimine(PEI) Sigma P3143
Tetraborate decahydrate Sigma B9876
Trypsin Sigma Sigma
Uridine Sigma U3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin human Sigma T1147
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma A4161
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Insulin Sigma I5500
PDGF Peprotech AF-100-13A
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Sodium selenite Sigma S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) Sigma T6397
T4 (L-Thyroxine) Sigma T1775
Co-culture media
apo-Transferrin human Sigma T1147
B27 supplement ThermoFisher 17504044
Biotin Sigma B4639
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma A4161
Ceruloplasmin Sigma 239799
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Hydrocortisone Sigma H4001
Insulin Sigma I5500
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A8199
Neurobasal ThermoFisher 21103049
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Progesterone Sigma P8783
Putrescin Sigma P5780
Recombinant Human CNTF Sigma 450-13
Sodium selenite Sigma S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) Sigma T6397
Vitamin B12 Sigma V6629
Tools
0.22 µm filter Sartorius 514-7010
1 mL syringe Terumo 1611127
100 mm Petri dish Dutscher 193100
15 mL tube Corning Life Science 734-1867
50 mL tube Corning Life Science 734-1869
60 mm Petri dish Dutscher 067003
70 µm filter Miltenyi Biotec 130-095-823
Binocular microscope Olympus SZX7
Curved forceps Fine Science Tools 11152-10
Fine forceps Fine Science Tools 91150-20
Large surgical scissors Fine Science Tools 14008-14
Scalpel Swann-morton 233-5528
Shaker Infors HT
Small surgical scissors Fine Science Tools 91460-11
Small surgical spoon Bar Naor Ltd BN2706
T150 cm2 flask with filter cap Dutscher 190151
Animal
P2 Wistar rat Janvier RjHAn:WI

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