RNA-Seq解析によるヒト原発性角化細胞のインビトロ分化の特徴

ヒト皮膚由来のヒト原発性角化細胞は、表皮^{1、2、3、4}の生物学を研究する細胞モデルとしてしばしば用^いられる。表皮の層は、ケラチノサイト分化法により、2D水没単層法または3Dエアリフトオルガノツモデル^{2、3、5、6、7}のいずれかでモデル化することができる。表皮の構造や機能を評価するために3Dモデルがますます重要になってきていますが、2D分化モデルは、その利便性と分析のために多数の細胞を生成する可能性のために、まだ広く使用されています。

血清の添加、カルシウムの高濃度、表皮成長因子受容体^2、3の低温および阻害を含む、2Dにおけるケラチノサイト分化を誘導するために様々な条件が適用されている。これらの各方法は、ケラチノサイト分化マーカー遺伝子の数によって検証されており、病理学的条件下を含むケラチノサイト分化の評価に有効であることが示されている。しかし、これらの誘導条件は、マーカー遺伝子の特定のパネルを^2,3に調べた場合の分化効率と運動学の違いも示す。

これらの方法の1つは、培養培地⁸におけるケラチノサイト接触阻害および成長因子の枯渇を含む。細胞が完全な密度に達すると、ケラチノサイトが自発的に分化することが示されています。 培養培地中の成長因子を除くと、さらに分化を増強することができる。接触阻害と枯渇成長因子を組み合わせた方法は、いくつかの表皮マーカー³を用いた場合に、通常の表皮に類似した遺伝子発現パターンを有する分化ケラチノサイトを生成することが示されており、このモデルは正常なケラチノサイト分化の研究に適していることを示唆している。最近、このモデルを用いたケラチノサイト分化の2つの包括的な遺伝子発現解析が^9,10に報告されている。研究者は、分子レベルでこのモデルを検証し、それが正常および病気のケラチノサイト分化を研究するために使用できることを示しました.

本プロトコルは、RNA-seqを用いた分化細胞のインビトロ分化法および分子解析の手順を説明する。また、分化0日目(増殖段階)、2日目、4日目、7日目(早期、中間、後期分化)における細胞の転写物の特徴を示す図である。分化された角化細胞は、表皮層の間に細胞に大きく似た遺伝子発現パターンを示す。この方法が皮膚病理の研究に使用できるかどうかを調べるために、同じ実験および分析パイプラインを適用して、眼球、外胚葉異形成および口唇口蓋裂症候群^11、12を有する患者に由来する転写因子p63の突然変異を運ぶ角化細胞を調査した。このプロトコルは、ケラチノサイトのインビトロ分化と、RNA-seqのその後のバイオインフォマティクス解析に焦点を当てています。RNA抽出、RNA-seqサンプル調製、ライブラリ構築などの完全な手順の他のステップは、十分に文書化されており、特に多くの一般的に使用される商用キットを使用する場合に簡単に従うことができます。したがって、これらの手順はプロトコルで簡単に説明するだけです。このデータは、このパイプラインが健康で病気のケラチノサイトにおける表皮分化中の分子事象を研究するのに適していることを示している。