Amostragem e Análise de Sinais de Aroma Animal

Muito pouco se sabe sobre as mudanças químicas que sustentam os sinais olfativos nos animais¹, também por causa dos desafios metodológicos no registro e quantificação de perfis químicos voláteis de odores². Existem várias armadilhas potenciais quando se trabalha com matrizes químicas altamente complexas; estes incluem na amostragem e análise das amostras de odor³.

No Centro de Ciências Rosalind Franklin, Universidade de Wolverhampton, estamos realizando a análise de odores e marcas de cheiro para entender como eles podem ser usados por animais. Combinamos semioquímica com ecologia comportamental, endocrinologia e citologia para melhorar nossa compreensão do papel desempenhado pelos sinais olfativos na comunicação animal.

Desenvolvemos uma metodologia e, em seguida, analisamos odores e marcas de uma variedade de espécies, incluindo vários primatas não humanos (ou seja, lêmures coroados, lêmures-vermelhos, macaques japoneses, babuínos de oliva, chimpanzés) e outros mamíferos (ou seja, gatos, vacas). Coletamos e analisamos uma variedade de amostras, incluindo urina, fezes, secreções de odor de cabelo e odor de glândulas odor. Estes odores e marcas de odor consistem em misturas complexas de compostos e, portanto, qualquer metodologia utilizada para sua análise precisa incluir alguma forma de técnica separada. Como ilustrado, também ocorrem em uma gama de matrizes que necessitam do uso de técnicas para extrair os componentes de interesse.

Estudos anteriores de Vaglio et al.⁴ e outros autores⁵ utilizaram extração dinâmica do headspace (DHS) com espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), enquanto a extração direta de solventes⁶ e extrações complexas de solventes⁷ também foram utilizadas. Particularmente, a amostragem dinâmica do headspace envolve a eliminação do espaço para a cabeça com um volume conhecido de gás inerte que, em última análise, remove todos os compostos voláteis, com exceção daqueles que mostram uma forte afinidade com a matriz amostral (por exemplo, compostos polares em amostras aquosas).

Para a metodologia atual, adotamos a técnica de microextração em fase sólida do headspace (HS-SPME) aliada ao GC-MS. Em particular, desenvolvemos e aprimoraram a metodologia já utilizada por Vaglio et al. em seu laboratório anterior GC-MS^8,9,10.

As técnicas de extração sem solvente são muito eficazes para analisar compostos pequenos e altamente voláteis (que de outra forma podem ser perdidos facilmente de uma amostra) porque esses métodos imobilizam compostos em um suporte de fase estável e sólido. O HS-SPME usa uma fibra revestida com um polímero adsorbente para capturar compostos voláteis no headspace da amostra ou para extrair compostos dissolvidos por imersão em um fluido biológico aquoso¹¹. O revestimento de polímero não liga fortemente os compostos, portanto, pelo aquecimento na porta de injeção do GC eles podem ser removidos. Este método é mais poderoso do que as técnicas de extração de solventes e também mais eficaz que o DHS.

Na abordagem atual, as amostras estão contidas dentro de frascos de vidro. Estes frascos são aquecidos a uma temperatura de 40 °C para simular a temperatura do corpo animal, a fim de promover os componentes voláteis da marca do perfume para ocupar o espaço da cabeça do frasco. Uma fibra SPME, revestida com 65 μm de material sorbente de polidimtilsiloxano/divinylbenzene (PDMS/DVB), é exposta ao ambiente do headspace e componentes voláteis da amostra são adsorvidos na fibra. Ao aquecer a fibra na porta de entrada de um GC-MS, os componentes voláteis são desordenados da fibra e, em seguida, separados pelo GC. Padrões de fragmentação espectral em massa são obtidos para cada componente usando o MS. Comparando esses espectros de massa com bancos de dados espectrais em massa, pode ser possível identificar provisoriamente os componentes da marca do perfume. Através do uso de um amostrador automático, podemos analisar várias amostras em lotes de forma consistente.

Dado que cada tipo de fibra SPME tem uma afinidade diferente com produtos químicos polares, a fibra geralmente é escolhida dependendo da polaridade e/ou peso molecular dos compostos químicos alvo. Além disso, as condições de GC são alteradas dependendo do tipo de coluna GC e das características dos compostos químicos alvo.

Esta técnica permite a análise semi-quantitativa dos componentes voláteis das marcas de odor, permitindo a separação e a identificação provisória dos componentes da amostra, seguida pela análise das razões de pico de área para procurar tendências que possam significar componentes da marcação do odor que possam estar envolvidos na sinalização.

Os principais pontos fortes desta abordagem atual são:

• A gama de tipos de amostra que podem ser analisados.
• Não são necessárias preparações ou extrações complexas da amostra.
• A capacidade de analisar componentes voláteis.
• A capacidade de separar os componentes de uma mistura.
• Para ser capaz de identificar os componentes detectados.
• A capacidade de fornecer informações semi-quantitativas e potencialmente quantitativas sobre os componentes detectados.