Özet

高速スキャン環状ボルタンメトリー(CIS-FSCV)による注入と刺激を組み合わせて、パジカルドーパミンの腹側テグメンタル領域受容体調節を評価する

Published: April 23, 2020
doi:

Özet

このプロトコルの目標は、直接腹側テグメンタル領域受容体を操作して、第二次ドーパミン放出への寄与を研究することです。

Abstract

腹側テグメンタル領域(VTA)から側坐核へのPhasicドーパミン(DA)放出は、報酬処理および強化学習において極めて重要な役割を果たす。VTA制御フェーシックDAリリースへの多様な神経入力を理解することは、報酬処理と強化学習を制御する回路のより良い画像を提供することができます。ここでは、インビボ高速スキャン環状ボルタンメトリー(FSCV)で測定した刺激誘発フェシクスDA放出(融合注入および刺激、またはCIS)を有する薬理学的アゴニストおよびアンタゴニストのVTAカニューレ内注入を組み合わせた方法を説明する。麻酔下ラットにCIS-FSCVを用い、カナンベン核の中で記録しながらカニューレを取り付けた双極電極でVTAを電気的に刺激することによって、フェースDA応答を誘発することができる。薬理学的アゴニストまたはアンタゴニストは、刺激部位に直接注入して、Phasic DA放出を駆動する上での特定のVTA受容体の役割を調査することができる。CIS-FSCVの大きな利点は、VTA受容体機能がインビボで研究できることです, インビトロ研究に基づいて構築.

Introduction

腹側テグメンタル領域(VTA)から側坐核(NAc)への放出は報酬関連の行動において重要な役割を果たす。VTA DAニューロンは、強壮性の発火(3~8Hz)からバースト状の発火(>14Hz)1に切り替え、NAcでフェージDA放出を生み出します。VTAは、強壮剤からバースト焼成2、3、4、5への切り替えを制御するのに適した位置にある様々なソマト樹状受容体発現する。これらの受容体のどれとそれぞれの入力を特定して、制御フェシカルDA放出は報酬関連回路がどのように組織されているかについての理解を深める。ここで説明する方法論の目的は、高速スキャン環状ボルタンメトリー(CIS-FSCV)との注入と刺激を組み合わせて、迅速かつ堅牢に駆動フェージックDA放出におけるVTA受容体の機能性を評価することである。

融合と刺激(CIS)を組み合わせた用語は、細胞のグループ(ここではVTA)上の受容体を薬理学的に操作し、それらのニューロンを刺激して受容体の機能を研究することを指します。麻酔ラットでは、高速スキャン環式ボルタンメトリー(FSCV)で測定したNAcコアに大きなフェージDA信号(1-2 μM)を呼び起こすためにVTAを電気的に刺激します。刺激部位における薬理学的薬剤(すなわち受容体アゴニスト/アンタゴニスト)の注入は、誘発されたフェースDA放出の後の変化を観察することによってVTA受容体の機能を測定するために使用することができる。FSCVは、高空間(50-100 μm)と時間(10Hz)の両方の解像度を楽しむ電気化学的アプローチであり、報酬関連のフェージックDAイベント6、7を測定するのに適しています。この解像度は、マイクロ透析などの他の生体内神経化学的測定よりも細かいものです。したがって、CIS-FSCVは、一緒に、フェースドーパミン放出のVTA受容体調節を評価するのに適している。

VTA受容体機能を調べる一般的な方法の1つは、それらの受容体がニューロン1,8の発火速度をどのように変化させるかを扱う電気生理学的アプローチの組み合わせを用いることである。これらの研究は、活性化時にDA発火を促進する際にどのような受容体が関与しているか理解する上で非常に貴重です。しかし,これらの研究は,軸索末端で下流に起こり得るものを示唆することしかできません(すなわち、神経伝達物質の放出)。CIS-FSCVは、VTAバースト焼成、フェーシックDA放出の出力がVTAデンドライトおよび細胞体上にある受容体によってどのように調節されているかに答えることによって、これらの電気生理学的研究に基づいています。したがって、CIS FSCVはこれらの電気生理学研究に基づいて構築するのに適しています。一例として、ニコチン受容体活性化はVTA9においてバースト発成を誘導することができ、そして麻酔ラットにおけるCIS-FSCVは、VTAにおけるニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)活性化もNAc10,11におけるフェージドDA放出を制御することを示すために使用された。

フェシカルDA規制の機械検査はまた、薬物の浴用途と一緒にスライス製剤を使用して一般的に研究されています.これらの研究は、多くの場合、細胞体がスライス12から除去されるようにドーパミン末端からのフェジーカルDA放出のシナプス前調節に焦点を当てる。これらの調製物はドーパミン末端に対するシナプス前受容体の効果を研究するのに価値があるのに対し、CIS-FSCVは、ドーパミンニューロンに対するソマトデン化受容体の効果、ならびにVTAへのシナプス前の入力を研究するのに適している。この区別は重要であり、VTAにおけるソマト樹状受容体活性化は、NAcシナプス前受容体活性化とは異なる効果を有し得るからである。実際、NAcにおけるドーパミン作動性シナプス前nAChRsを遮断すると、バースト焼成13中にパシズムドーパミン放出を上昇させることができるが、その反対はVTAソマトデンドリックnAChDrcnAChRs10,11に当てはまる。

CIS FSCVは、VTA受容体がフェースDA放出を調節する能力を研究するための理想的なアプローチです。重要なことに、このアプローチは、麻酔または自由移動のいずれか、無傷のラットで行うことができます。このアプローチは急性期研究に適し、そのベースライン状態10、14の受容体機能を研究するとともに薬物暴露後または行動操作11、15の後の受容体の機能的変化を評価できる長期研究を行

Protocol

すべての実験は、国立衛生研究所(NIH)実験動物のケアと使用ガイドに従って行われ、エリザベスタウン・カレッジとイェール大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)の両方によって承認されました。このプロトコルは、CIS-FSCVを利用する麻酔ラット調製に固有のものです。 1. 術前の準備 電極溶液調製 電極バックフィル溶液を作るために、140 mM塩化カリウム<…

Representative Results

CIS-FSCVは、NAcコアにおけるフェスジカルDA放出を駆動するVTA N-メチル-D-アスパラギン酸受容体(NMDAR)、ニコチン性アセチルコリン受容体(nACHRs)、ムスカリン性アセチルコリン受容体(mACHRs)の機能を研究するために使用されました。 図2 は、陰性対照の代表的なデータを示し、生理食糸0.9%の注入、前(ベースライン)および9分のポストインフュージョン…

Discussion

CIS-FSCVは、Phasic DA放出の基礎となるVTA受容体機構を調査するユニークな機会を提供します。適切な記録を確実にするためには、2つの重要なステップがあります。まず、安定したベースライン記録を達成する必要があります。安定した記録を確立する可能性を高める重要な方法は、電極が60 Hzと10 Hzの両方でサイクルするのに十分な時間を持っていることを確認することです(通常、60 Hzでは15分?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

エリザベスタウン・カレッジ(R.J.W,M.L.,L.M.),NSF大学院フェローシップ(R.J.W.),イェール大学医学部(N.A.)の支援を受けました。

Materials

Electrode Filling Solution/Supplies
Micropipette World Precision Instruments MF286-5 (28 gauge)
Potassium Acetate Sigma 236497-100G
Potassium Chloride Sigma P3911-25G
Electrode Supplies
Carbon fiber Thornel T650
Electrode puller Narishige International PE-22 Note: horizontal pullers can be used as well
Glass capillary A-M systems 626000
Insulated wires for electrodes Weico Wire and Cable Incorporated UL 1423 Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire
Light Microscope (for viewing and cutting electrode) Fischer Scientific M3700
Pin Phoenix Enterprises HWS1646 To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage
Putty Alcolin 23922-1003 Used to place electrode on while cutting the carbon fiber
Scalpal Blade World Precision Instruments 500239 For cutting carbon fiber to the apprpriate length
Silver Wire Sigma 327026-4G
FSCV Hardware/Software
Faraday Cage U-Line H-3618 (36" x 24" x 42")
Potentiostat Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Stimulating electrode PlasticsOne MS303/2-A/SPC when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
TarHeel HDCV Software University of North Carolina-Chapel Hill https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
UEI breakout box Univ. of N. Carolina, Electronics Facility https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
UEI power supply Univ. of N. Carolina, Electronics Facility https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
Stimulator Hardware
Neurolog stimulus isolator Digitimer Ltd. DS4 Neurolog 800A
Infusion/Stimulation Supplies
Infusion Pump New Era Syringe Pump NE-300
Internal Cannula PlasticsOne C315I/SPC INTERNAL 33GA
Microliter Syringe Hamilton 80308
Tubing PlasticsOne C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50
Surgical Supplies
Cannula Holder Kopf Instruments 1776 P-1
Cotton Tip Applicators Vitality Medical 806
Electrode Holder Kopf Instruments 1770
Heating Pad Kent Scientific RT-0501
Povidone Iodine Vitality Medical 29906-004
Screws Stoelting Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 1.59 mm O.D., 3.2 mm long
Silver wire reference with AgCl InVivo Metric E255A
Square Gauze Vitality Medical 441408
Stereotax Kopf Instruments Model 902 (Dual Arm Bar)
Histological Supplies
Formulin Sigma 1004960700
Power supply BK Precision 9110
Sucrose Sigma 80497
Tungsten microelectrode MicroProbes WE30030.5A3
Drugs for infusions
((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma Aldrich A5282
N-methyl-D-aspartate Sigma Aldrich M3262
Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) Sigma Aldrich M9020
Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) Sigma Aldrich S0929

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