Usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato

A aplicação da espectrometria de massa revolucionou o estudo do metabolismo. Perfil metabólico direcionado e rastreamento metabolômico permitem monitoramento preciso das mudanças no metabolismo energético. No entanto, a realização de metabolômica saem com sucesso requer treinamento extensivo, pessoal experiente e espectrômetros de massa caros e altamente sensíveis não prontamente disponíveis para todos os laboratórios. Nos últimos anos, usando um analisador de fluxo extracelular, como o Seahorse XFe96 tem crescido popular como um método substituto para medir as mudanças no metabolismo energético em vários tipos de células^1,2,3,4,5.

Os espermatozóides são células motil altamente especializadas; cuja tarefa é entregar o genoma paterno ao ócito. O esperma que sae do intervalo reprodutivo masculino após a ejaculação é ainda funcional imaturo e não pode fertilizar o oócito porque são incapazes de penetrar as vestes dos oócitos. O esperma adquire a competência da fecundação enquanto transitam através do intervalo reprodutivo fêmea em um processo da maturação sabido como a capacitação^6,7. Esperma ou esperma recém-ejaculado dissecado do epididímos cauda podem ser capacitados in vitro por incubação em meios de capacitação definido contendo Ca^2+,bicarbonato (HCO₃^–) ou um analógico de axigônta permeável celular (por exemplo, dibutyryl-cAMP), um aceitador de colesterol (por exemplo, albumina de soro bovina, BSA) e uma fonte de energia (por exemplo, glicose). Durante a capacitação, o esperma modifica seu padrão de motilidade em uma batida flagelar assimétrica, representando um modo de natação chamado hiperativação^8,9,e eles se tornam competentes para se submeter à reação acrosome⁷, onde enzimas proteolíticas são liberados que digerem os vestments dos oócitos. Estes processos requerem energia, e semelhante sasmáticas, espermatozóides geram ATP e outros compostos de alta energia através da glicolíse, bem como ciclo de TCA mitocondrial e fosforilação oxidativa (oxphos)¹⁰. Enquanto vários estudos demonstram que a glicolyse é necessária e suficiente para suportar a capacitação de^{espermatozóides 11,12,13,14}, a contribuição do oxphos é menos clara. Ao contrário de outros tipos de células onde a glicolíse é fisicamente acoplado ao ciclo tca, espermatozóides são altamente compartimentados e são pensados para manter esses processos em compartimentos flagelar separados: o midpiece concentra a maquinaria mitocondrial, enquanto as enzimas-chave da glicolíse parecem ser restritas à peça principal^15,16. Esta compartimentação resulta em um debate em curso sobre se o piruvato produzido na peça principal por glicolíse pode suportar oxphos mitocondrial no meio, e se ATP produzido por oxphos no midpiece seria capaz de difundir suficientemente rapidamente ao longo do comprimento do flagellum para suportar as necessidades energéticas em partes^distaisda peça principal 17^,18,19. Há também o apoio de um papel para o oxphos na capacitação de espermatozóides. Não só o oxphos é mais favorável do que a glicolíse, gerando 16 vezes mais ATP do que a glicolíse, mas o volume médio e o conteúdo mitocondrial estão diretamente correlacionados com a aptidão reprodutiva em espécies de mamíferos que apresentam maiores graus de competição entre os machos para os companheiros²⁰. Abordar essas questões requer métodos para examinar as contribuições relativas de glicolíse e oxphos durante a capacitação do esperma.

Tourmente et al. aplicaram um analisador de fluxo extracelular de 24 poços para comparar o metabolismo energético de espécies de camundongos intimamente relacionadas com parâmetros de desempenho de^esperma21significativamente diferentes. Em vez de relatar os valores basal de ECAR e de OCR do esperma non-capacitated, aqui, nós adaptamos seu método usando um analisador extracelular do fluxo de 96 poços para monitorar mudanças no metabolismo de energia durante a capacitação do esperma do rato no tempo real. Desenvolvemos um método que permite monitorar simultaneamente a glicolíse e o oxphos em tempo real em espermatozóides com flagela batendo em até doze condições experimentais diferentes, medindo o fluxo de oxigênio (O₂₎e prótons (H⁺) (Figura 1A). Devido à quebra de piruvato para lactato durante a glicolíse e a produção de CO₂ através do ciclo TCA, espermatozóides não capacitados e capacitados extrude H⁺ nos meios de ensaio que são detectados pelo analisador de fluxo extracelular via H⁺fluorofosfos sensíveis imobilizados para a ponta da sonda de um cartucho de sensor. Em paralelo, o consumo de O₂ por fosforilação oxidativa é detectado via O₂-fluorofóbicos sensíveis imobilizados até a mesma ponta da sonda (Figura 1B). A detecção eficaz do H⁺ liberado e consumiu O₂ requer um amortecedor de esperma modificado com baixa capacidade de tampão sem bicarbonato ou fenol vermelho. Assim, para induzir a capacitação na ausência de bicarbonato, adotamos o uso de um analógico de cAMP permeável celular injetado juntamente com o inibidor de PDE de ampla gama IBMX²². Três portos de injeção independentes adicionais permitem a injeção de ativadores farmacológicos e/ou inibidores, o que facilita a detecção em tempo real de alterações na taxa de respiração celular e glicolíse devido à manipulação experimental.