Özet

細胞外フラックス分析装置を用いてマウス精子容量化時の糖質および酸化リン酸化の変化を測定する

Published: January 22, 2020
doi:

Özet

マウス精子容量中の糖質および酸化リン酸化のリアルタイム変化を監視する細胞外フラックス分析装置の応用について説明する。

Abstract

哺乳類の精子は、容量として知られているプロセスで女性の生殖管で受精能力を獲得します。容量関連プロセスにはエネルギーが必要です。精子の進行性運動性、容量、過活性化、およびアクロソーム反応を燃料とするATPを生成するソースに関する議論が続いています。ここでは、マウス精子容量のエネルギー代謝の変化を解析するツールとしての細胞外フラックス分析装置の応用について説明する。H+– および O2– 感受性蛍光体を使用して、この方法は、非容量化対容量性精子でリアルタイムでの糖和および酸化リン酸化を監視することを可能にします。異なるエネルギー基質および/または薬理活性剤および/または阻害剤の存在下でこのアッセイを使用すると、異なる代謝経路の寄与および精子の容量化中のシグナル伝達カスケードと代謝の交点に関する重要な洞察を提供することができる。

Introduction

質量分析法の応用は代謝の研究に革命をもたらした。標的代謝プロファイリングとメタボロミクストレースにより、エネルギー代謝の変化を正確にモニタリングできます。しかし、メタボロミクスを成功させるには、広範なトレーニング、経験豊富なスタッフ、および高価で機密性の高い質量分析計が必要です。近年、シーホースXFe96などの細胞外フラックス分析装置を用いて、種々の細胞型1、2、3、4、5のエネルギー代謝の変化を測定する代理法として普及している。

精子は高度に専門化された運動細胞です。その仕事は、卵母細胞に父性ゲノムを提供することです。射精後に男性の生殖管を離れる精子はまだ機能的に未熟であり、卵母細胞のベストを貫通できないため、卵母細胞を受精させることができない。精子は、容量6、7として知られている成熟プロセスで女性の生殖管を通過する時に受精能力を獲得する。カウダ精巣上体から解剖された新鮮に射精した精子または精子は、Ca2+、重炭酸塩(HCO3−)または細胞透過性cAMPアナログ(例えば、ジブチリルcAMP)、コレステロールアクセプター(例えば、ウシ血清アルブミン、BSA)、およびグルコース(例えば、ウシ血清アルブミン)を含む定義された容量媒体中のインキュベーションによってインビトロで容量化することができる。容量化の間、精子は運動パターンを非対称フラジェラ拍動に変え、過活性化8、9と呼ばれる水泳モードを表し、卵母細胞のベストを消化するタンパク質分解酵素が放出されるアクロソーム反応7を受ける能力を持つようになる。これらのプロセスは、エネルギーを必要とし、および体細胞と同様に、精子は、糖和を介してATPおよび他の高エネルギー化合物を生成するだけでなく、ミトコンドリアTCAサイクルおよび酸化リン酸化(oxphos)10を生成する。複数の研究は、糖質上昇が必要であり、精子の容量化を支するのに十分であることを示しているが、オックスフォスの寄与はあまり明らかではない。糖分解がTCAサイクルに物理的に結合されている他の細胞タイプとは対照的に、精子は非常に区画化され、これらのプロセスを別々の旗手コンパートメントに維持すると考えられている:ミッドピースはミトコンドリア機械を濃縮し、一方、糖分解の主要な酵素は主片15、16に制限されているように見える。この区画化は、グリコリシスによって主な部分で産生されるピルビン酸がミトコンドリアオックスホスを中間部分で支えることができるかどうか、そしてミッドピース中のオックスホスによって産生されるATPが、主片17、18、19の遠位部分のエネルギー要件をサポートするためにフラグラムの長さに沿って十分に迅速に拡散することができるかどうかについての議論を続ける。精子の容量におけるオックスホスの役割のサポートもあります。オックスホスは、糖酸化物よりも精力的に有利であるだけでなく、糖和よりも16倍多くのATPを生成するが、ミッドピース体積およびミトコンドリア含有量は、仲間20のための男性間のより大きな競争度を示す哺乳動物種における生殖適性と直接相関している。これらの質問に対処するには、精子の容量化中に糖質およびオックスホスの相対的な寄与を調べるための方法が必要です。

Tourmenteららは、24ウェル細胞外フラックス分析装置を適用し、有意に異なる精子性能パラメータ21と密接に関連するマウス種のエネルギー代謝を比較した。ここでは、非容量性精子の基底ECAR値とOCR値を報告する代わりに、96ウェルの細胞外フラックスアナライザを用いて、マウス精子容量のエネルギー代謝の変化をリアルタイムでモニタリングする方法を適応させます。酸素のフラックス(O2)とプロトン(H+)を測定することにより、最大12の異なる実験条件でフラゲラを打つ精子で糖質およびオックスホスをリアルタイムでリアルタイムにモニタリングできる方法を開発しました(図1A)。糖分解中の乳酸へのピルビン酸の分解とTCAサイクルを介したCO2の産生により、非容量および容量化された精子は、H+-感受性フルオロフォアを介して細胞外フラックスアナライザによって検出されるアッセイ媒体にH+を押し出し、センサカートリッジのプローブ先端に固定化します。並行して、酸化リン酸化によるO2消費は、同じプローブ先端に固定化されたO2感受性フルオロフォアを介して検出される(図1B)。放出されたH+および消費されたO2の効果的な検出は、重炭酸塩またはフェノール赤色なしで低い緩衝能を有する修飾精子緩衝液を必要とする。従って、重炭酸塩の非存在下で容量を誘導するために、広範囲PDE阻害剤IBMX22と共に注入された細胞透過性cAMPアナログの使用を採用した。3つの追加の独立した注入ポートは、薬理活性剤および/または阻害剤の注入を可能にし、実験的操作による細胞呼吸および糖上昇率の変化のリアルタイム検出を容易にする。

Protocol

精子は8-16週齢のCD-1雄マウスから採取される。動物実験は、ワイル・コーネル医学の制度的動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認された。 1. アッセイの前日 センサカートリッジおよび細胞外フラックスアナライザキャリブラントの調製 センサーカートリッジを水和するには、XFe96細胞外フラックスアッセイキットからセンサーカートリッ?…

Representative Results

この方法では、細胞外フラックスアナライザを使用して、マウス精子の容量中の糖質およびオックスフォスの速度のリアルタイム変化を監視します。図4は、精子が唯一のエネルギー基質としてグルコースの存在下で容量化し、薬理学的モジュレーターとして2-DGとアンチマイシンとロテノンを有する例示的な実験を示す。細胞外フラックス分析?…

Discussion

特定の代謝基質または重要な代謝酵素がない場合の精子容量の喪失は、受精の成功を支える重要な要因としてエネルギー代謝を明らかにした。細胞活性化中の代謝スイッチは、他の細胞型では確立された概念ですが、精子が容量の増加するエネルギー需要にどのように代謝を適応させるかがわかり始めています。細胞外フラックス分析装置を用いて、精子の容量化中に糖質および酸化リン酸?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、ロックフェラーハイスループットと分光リソースセンターのラヴォワジエ・ラモス・エスピリトゥ博士の支援を認めたい。

Materials

Reagents
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich D8375 2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I7018 IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A1470 BSA
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) Sigma-Aldrich L7381 ConA
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Hepes Sigma-Aldrich H0887
Isothesia Henry Schein Animal Health 1169567761 Isoflurane
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt Sigma-Aldrich D0627 db-cAMP
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333 KCl
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P5655 KH2PO4
Rotenone Cayman Chemical Company 13995 Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3-
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888 NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μL eppendorf ES-12-100
12 channel pipette 50-300 μL vwr 613-5257
37 °C, non-CO2 incubator vwr 1545
5 mL cetrifuge tubes eppendorf 30119380
50 mL conical centrifuge tubes vwr 76211-286
Centrifuge with plate adapter Thermo Scientific IEC FL40R
Dissection kit World Precision Instruments MOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objective Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided Thomas Scientific 1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided Thomas Scientific 1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.

Referanslar

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