Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Rekha Rangarajan; Howard  A. Ketelson; Richard Do; David J. McCanna; Adeline Suko; Daryl Enstone; Lakshman N. Subbaraman; Jaya Dantam; Lyndon W. Jones

doi:10.3791/60812

JoVE Journal > Medicine

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Tıp

Wirkung künstlicher Tränenformulierungen auf die Metabolische Aktivität menschlicher Hornhautepithelzellen nach Exposition gegenüber Dericcation

Published: May 02, 2020

doi:

10.3791/60812

Rekha Rangarajan¹, Howard A. Ketelson¹, Richard Do², David J. McCanna², Adeline Suko², Daryl Enstone², Lakshman N. Subbaraman¹, Jaya Dantam², Lyndon W. Jones²

¹Alcon Vision, LLC, ²Centre for Ocular Research and Education (CORE), School of Optometry & Vision Science,University of Waterloo

Özet

Ziel dieses Protokolls ist es zu bewerten, ob verschiedene künstliche Tränenformulierungen menschliche Hornhautepithelzellen mit einem In-vitro-Modell vor der Austrocknung schützen können. Nach der Exposition gegenüber künstlichen Tränenformulierungen und Dericcation werden menschliche Hornhautepithelzellen auf metabolische Aktivität untersucht.

Abstract

Künstliche lipidhaltige Tränenformulierungen werden entwickelt, um die Tränenverdunstung durch die Wiederherstellung einer mangelhaften Tränenfettschicht zu reduzieren. Künstliche Tränenformulierungen, die die Zellaustrocknung verhindern, führen zu einem Schutz der Okulären Oberfläche und zur Aufrechterhaltung der zellmetabolischen Aktivität. Während der Dehydrierung durchlaufen die Zellen den Prozess des Verlusts der metabolischen Aktivität und anschließend des Zelltodes. Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit künstlicher Tränenformulierungen. Der stoffwechselmetarebolische Farbstoff (d.h. alamarBlue) wandelt sich von einem niedrig fluoreszierenden Molekül Resazurin zu einem fluoreszierenden Molekül resorufin in lebensfähigen Zellen. Die biologische Leistungsfähigkeit einer künstlichen Tränenformulierung wird gemessen, da die Formulierung (a) die Zelllebensfähigkeit aufrechterhält und (b) den Zellschutz vor Austrocknung bietet. Wachstumsmedien und Salzsäure werden als Steuerelemente für die Zelllebensfähigkeits-/Austrocknungstests verwendet. Die Zellen werden mit Testlösungen für 30 min inkubiert und dann für 0 oder 5 min bei 37 °C und 45% relativer Luftfeuchtigkeit ausgetrocknet. Die zellmetabolische Aktivität nach der Erstexposition und nach der Zellaustrocknung wird dann bestimmt. Die Ergebnisse zeigen die vergleichenden Auswirkungen von Augentropfenformulierungen auf die zellmetabolische Aktivität und den Austrocknungsschutz. Diese Methode kann verwendet werden, um trockene Augenformulierungen zu testen, die entwickelt wurden, um Personen mit verdunstendem trockenem Auge zu behandeln.

Introduction

Viele verschiedene Inhaltsstoffe in mehrdosierten ophthalmologischen Lösungen werden benötigt, um Stabilität, pH-Wert, Osmolarität und Wirksamkeit zu erhalten. Einige Chemikalien wie Konservierungsstoffe oder Tenside in Augenlösungen können jedoch Schäden am Hornhautepithel¹^,²verursachen. Zelllebensfähigkeitstests mit humanen Hornhautepithelzellen (HCEC) können durchgeführt werden, um die potenziellen Schäden zu bewerten, die durch diese verschiedenen Inhaltsstoffe in ophthalmologischen Formulierungen verursacht werden. Einer der In-vitro-Assays, die besonders nützlich für die Beurteilung von Zellschäden sind, ist der alamarBlue-Assay³. In diesem Test enthält der Stoffwechselfarbstoff (d.h. alamarBlue) Resazurin, das als Zelllebensfähigkeitsindikator fungiert. Während der zellulären Atmung wird Resazurin durch die Aufnahme von Elektronen⁴auf Resorufin reduziert. Die Reduktion von Resorufin bewirkt einen Wechsel von einem nicht fluoreszierenden Molekül zu einem fluoreszierenden Molekül, das mit einem Spektrofluorometer⁵detektiert werden kann.

Diese Untersuchung verwendet zwei verschiedene Behandlungen der Hornhautepithelzellen, um zu bestimmen, wie trockene Augenprodukte in einem In-vitro-Modell funktionieren können. Bei der ersten Auswertung werden die Zellen 30 min lang mit diesen Produkten behandelt. Nach der Behandlung werden die Zellen unmittelbar nach der Exposition gegenüber den trockenen Augenprodukten und nach einem Erholungszeitintervall auf metabolische Aktivität untersucht. Diese Bewertung bestimmt die Wirkung dieser Produkte auf die Zellen vor der Austrocknung in einer Feuchtekammer. Lösungskonservierungsmittel, Tenside oder Puffer in diesen Lösungen können einige zytotoxische Wirkungen auf die Zellen haben, die mit dem metabolischen Farbstoff nachgewiesen werden können.

Die zweite Auswertung bestimmt die metabolische Aktivität der Zellen nach Exposition gegenüber den trockenen Augenprodukten und der Austrocknung. Wenn die Produktbehandlung den Zellen Schutz vor Austrocknungsschäden bietet, wird bei dieser Beurteilung die Stoffwechselaktivität der Zellen aufrechterhalten. Ein Zellschutz vor den schädlichen Auswirkungen der Austrocknung kann auftreten, wenn das trockene Augenprodukt die Zellen mit Lipiden beschichten kann oder das Produkt Flüssigkeit aus der Umgebung aufnehmen kann, die den Zellen Feuchtigkeit hinzufügt.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um schwere Bedingungen der Umweltbelastung von Zellen zu simulieren. Andere Studien haben verschiedene Modelle verwendet, um diese äußere Belastung zu erzeugen. Einige Studien haben die Zellen in laminaren Strömungshauben⁶^,⁷^,⁸, während andere Raumtemperatur und verschiedene relative Luftfeuchtigkeit (RH) Werte⁹^,¹⁰^,¹¹verwendet haben. Eine Methode zur Simulation trockener Augenbedingungen ist es, die Osmolarität der Inkubationslösung¹²^,¹³zu erhöhen. Eine weitere In-vitro-Methode zur Simulation unerwünschter Umweltbedingungen ist die Hinzusagung von Zytokinen in den Zellmedien, um die Tränenflüssigkeit von Patienten mit trockenem Auge zu simulieren¹⁴. Obwohl diese Tests interessante Modelle sind, die bewerten können, wie Chemikalien osmotischen Stress reduzieren oder das Immunsystem stimulieren können, zeigen diese Modelle nicht direkt, wie chemische Formulierungen Zellen vor Austrocknungsstress schützen können.

Das Trocknungsmodell verwendet eine Temperatur-/Feuchtigkeitskammer 37 °C und 45% RH. Es simuliert Umgebungsbedingungen, die verdunsten von der Augenoberfläche verursachen können. Mit dieser Methode können auch Simulationen anderer extremer Umgebungsbedingungen wie die niedrige Luftfeuchtigkeit in Flugzeugkabinen¹⁵ oder in Innenräumen in den Wintermonaten¹⁶ durchgeführt werden.

Die Zellkulturmodellierung wird verwendet, um die Wirkung von Austrocknungsstress auf die menschliche Hornhaut zu simulieren. Um Zellstress zu erkennen, werden Zelllebensfähigkeitstests durchgeführt, um die Auswirkungen auf die Zellgesundheit zu bestimmen. Mehrere verschiedene physiologische Tests können an Zellen durchgeführt werden, um festzustellen, ob sie gestresst sind¹⁷. Die in diesem Testverfahren durchgeführte Analyse verwendet den handelsüblichen Stoffwechselfarbstoff (Materialtabelle). Es hat den Vorteil gegenüber vielen anderen Zellstresstests, dass es ungiftig, in Wachstumsmedien löslich ist und Zellen ohne Zellfixierung bewerten kann¹⁸. In diesem Verfahren werden die Zellen unmittelbar nach jeder Behandlung auf metabolische Aktivität getestet und ein zweiter Satz von Zellen wieder in Wachstumsmedien platziert und nach 18 h Erholung ausgewertet. Der Grund für die Tests sofort und dann nach einer Erholungsphase ist zellschädigend zu identifizieren, die unmittelbare Auswirkungen auf die stoffwechselmetabolische Aktivität und Zellschäden verursacht, die verzögerte Effekte verursacht. Außerdem bietet es die Möglichkeit, die Auswirkungen dieser Formulierungen auf kurzfristige oder langfristige Schäden und die Fähigkeit der Formulierungen zu bewerten, sich von der anfänglichen Beleidigung zu erholen/ nicht zu erholen.

Diese Untersuchung wird verwendet, um verschiedene lipidhaltige Trockenaugenprodukte auf ihre Wirkung auf die HCEC-Stoffwechselaktivität mit und ohne Austrocknung zu vergleichen. Die Inhaltsstoffe in den getesteten Trockenaugenprodukten sind in der Tabelle der Materialienbeschrieben. Die Bestandteile in Lösung #1 sind Carboxymethylcellulose-Natrium (0,5%), Glycerin (1%) und Polysorbat 80 (0,5%), in Lösung #2 sie leichtes Mineralöl (1,0%) sind. und Mineralöl (4,5%), und in Lösung #3 das Lipid ist Mineralöl und Propylenglykol ist der demulcent. Diese Lipide sind die Formulierungskomponenten, von denen erwartet wird, dass sie den HCEC vor der Austrocknung schützen.

Protocol

1. Menschliche Hornhautepithelzellkultur Wachsen Sie verewigt HCEC19 in kollagenbeschichteten 75 cm2 Kolben mit 20 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium/Nährstoff-Gemisch F-12 (DMEM/F12) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin bei 37 °C mit 5%CO2.HINWEIS: Schütteln ist nicht erforderlich. Wechseln Sie die Medien alle 2 bis 3 Tage. 2. Vorbereitung von Zellen für Tests Nachdem die Zellen sind fast konfluent entfernen Kulturmedien. Fügen Sie je 75 cm2 Kolben 4 x 6 ml Zelldisassoziationslösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, bis sich die Zellen lösen (ca. 20 bis 30 min), und überprüfen Sie regelmäßig unter dem Mikroskop. Fügen Sie 2 x 6 ml DMEM/F12 mit 10% FBS zu je 75 cm2 Kolben hinzu. Den Inhalt des Kolbens in ein 50 ml Zentrifugenrohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 x 500 x g für 5 min. Pipet den Überstand heraus und suspendieren Sie die Zellen in vorgewärmten Medien. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie das Medienvolumen, das insgesamt 1 x 105 Zellen enthält. Fügen Sie 1 x 105 Zellen zu jedem Brunnen einer 48 gut kollagen-1 beschichteten Kulturplatte hinzu. Fügen Sie genügend Medien zum Brunnen hinzu, so dass das endgültige Medienvolumen im Brunnen 0,5 ml Kultur DMEM/F12 mit 10% FBS beträgt.HINWEIS: Eine künstliche Tränenformulierung kann zytotoxizität verursachen, die durch eine Abnahme der Metabolischen Aktivität von HCEC gemessen werden kann. Die Konsistenz der Daten hängt davon ab, dass jedem Bohrloch beim Seeding die gleiche Anzahl von HCEC hinzugefügt wird. Die Kulturkonzentration, die für 48 Wellplatten empfohlen wird, beträgt 1 x 105. Da sich Säugetierzellen nach dem Resuspendieren im Zentrifugenrohr absetzen können, wird empfohlen, die Zellen durch Rühren häufig wieder auszusetzen, während die Platten mit Zellen gesät werden, so dass die Zellsuspension die HCEC gleichmäßig verteilt hat. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h. 3. Kein Austrocknungsprotokoll Kontrollverfahren Nach der 24 h Inkubation entfernen Sie die Kulturmedien von der Platte. Sofortige Behandlung mit 150 l einer Testformulierungs- und Mediensteuerungslösung. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 30 min. Entfernen Sie die Testlösungen aus den Zellen. Fügen Sie 0,5 ml von 10% metabolische Farbstofflösung hinzu, um auf metabolische Aktivität zu testen. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 4 h bei 37 °C und 5%CO2. Nach der 4 h Inkubationszeit 100 l metabolische Farbstofflösung aus jedem Brunnen entfernen und jeweils 100 l in einen Brunnen einer 96-Well-Platte geben. Messen Sie die Fluoreszenz jedes Brunnens mit einem Fluoreszenzplattenleser (Tabelle der Materialien). Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 540 nm und die Emissionswellenlänge auf 590 nm ein. Kein Austrocknungsprotokoll (Wiederherstellungsverfahren) Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 bis 3.1.4. Fügen Sie 0,5 ml DMEM/F12-Medien zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie einen Satz von Kulturen für 18 h bei 37 °C und 5%CO2. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 0,5 ml von 10% metabolische Farbstofflösung. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.6 und 3.1.7. 4. Desiccation-Protokoll Kontrollverfahren Entfernen Sie nach der 24-stunden-Inkubation (Schritt 2.8) die Kulturmedien von der Platte. Sofortige Behandlung mit 150 l einer Testformulierungs- und Mediensteuerungslösung. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 30 min. Entfernen Sie die Testlösungen aus den Zellen. Legen Sie die Zellen in eine 37 °C und 45% RH-Kammer für 5 min, um die Zellen zu entachten. Fügen Sie 0,5 ml von 10% metabolischen Farbstofflösung hinzufügen, um die metabolische Aktivität zu testen. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 4 h bei 37 °C und 5%CO2. Nach der 4 h Inkubationszeit 100 l metabolische Farbstofflösung aus jedem Brunnen entfernen und jeweils 100 l in einen Brunnen einer 96-Well-Platte geben. Messen Sie die Fluoreszenz jedes Brunnens mit einem fluoreszierenden Plattenleser. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 540 nm und die Emissionswellenlänge auf 590 nm ein. Wiederherstellungsverfahren Wiederholen Sie die Schritte 4.1.1-4.1.5. Fügen Sie 0,5 ml DMEM/F12-Medien zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie einen Satz von Kulturen für 18 h bei 37 °C und 5%CO2. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 0,5 ml von 10% metabolische Farbstofflösung. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.7 und 4.1.8. 5. Datenanalyse Berechnen Sie die durchschnittliche Fluoreszenz der Mediensteuerung. Berechnen Sie die prozentuale Lebensfähigkeit der Stichprobe mit der folgenden Formel:Prozentuale Lebensfähigkeit der Probe = Probenfluoreszenz/Medienkontrollfluoreszenz x 100HINWEIS: Der Medienkontrolldurchschnitt liegt bei 100 % Lebensfähigkeit. Der Stoffwechselfarbstoff selbst hat eine kleine Menge an Fluoreszenz damit verbunden. Die Fluoreszenz des metabolischen Farbstoffreagenz kann von der Kontroll- und Testprobenfluoreszenz abgezogen werden, bevor die % Lebensfähigkeit der Testproben zur Medienkontrolle berechnet wird. Führen Sie einen Normalitätstest und einen Test auf gleiche Abweichungen an den Kontroll- und Testproben durch. Wenn der Normalitätstest erfolgreich ist und die Varianzen gleich sind, führen Sie eine einseitige ANOVA aus. Um signifikante Unterschiede zwischen bestimmten Gruppen zu identifizieren, führen Sie einen paarweiseVergleich nach dem hoc-Test durch (d. h. die mehrfachen Vergleichstests von Tukey oder Dunnett). Wenn der Normalitätstest erfolgreich ist und die Varianzen unterschiedlich sind, führen Sie die Welch-ANOVA aus. Um signifikante Unterschiede zwischen bestimmten Gruppen zu identifizieren, führen Sie einen paarweiseVergleich nach dem hoc-Test durch (d. h. Dunnetts oder Games-Howell-Tests für mehrere Vergleiche). Wenn der Normalitätstest fehlschlägt, verwenden Sie einen nichtparametrischen Test (d. h. Kruskal-Wallis-Test). Um signifikante Unterschiede zwischen bestimmten Gruppen zu identifizieren, führen Sie einen paarweiseVergleich nach dem hoc-Test (d. h. Dunns Test) durch.

Representative Results

Die Ergebnisse einer Studie zum Vergleich von drei Trockenaugenformulierungen sind in Abbildung 1dargestellt. Diese Abbildung zeigt, dass es Unterschiede in der Wirkung der drei Produkte, Lösung #1, Lösung #2 und Lösung #3 (Tabelle der Materialien) auf die Lebensfähigkeit von HCEC haben. Lösung #1 und Lösung #2 hatten einen signifikanten Einfluss auf die metabolische Aktivität von HCEC vor der Austrocknung. Dies bedeutet, dass es Formulierungskomponenten in diesen Produkten gibt, die die Stoffwechselaktivität des HCEC stören können. Der zusätzliche Rückgang der zellmetabolischen Aktivität, der nach 18 h Wiederherstellung von Zellen auftrat, die Lösung #1 ausgesetzt waren, zeigt, dass HCEC zunächst verletzt wurde und nach 18 h die Verletzung nicht repariert wurde. Im Vergleich dazu hatte die Lösung #3 nur eine leichte Wirkung auf die Stoffwechselaktivität des HCEC. Abbildung 2 zeigt die Wirkung dieser lipidhaltigen Trockenaugenformulierungen auf den Zellschutz. Bei einer fast 0% HCEC-Stoffwechselaktivität im 18-stunden-Erholungsintervall schützten Lösungs- #1 und Lösungs-#2 die Zellen nicht vor Austrocknungsstress. Lösung#3 bot jedoch einen gewissen Schutz vor Austrocknungsstress. Abbildung 1: Wirkung von trockenen Augen lipid verstärkten Produkten auf die Zelllebensfähigkeit. Relative Lebensfähigkeit gemessen durch HCEC-Stoffwechselaktivität nach Behandlung mit lipidhaltigen Trockenaugenprodukten. * = statistische Signifikanz (p < 0,05) bezogen auf Lösung #3, n = statistische Signifikanz (p < 0,05) relativ zur Mediensteuerung für den entsprechenden Erholungszeitraum. Die Höhe des Balkens stellt den Mittelwert dar, und die Fehlerbalken sind die SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Wirkung von trockenen Augen lipid verstärkte Produkte auf den Austrocknungsschutz. Wirkung von lipidhaltigen Trockenaugenformulierungen auf den Zellschutz. Lösung#1 und Lösung #2 zellennicht vor Austrocknungsstress schützten, und sie erholten sich im Laufe der Zeit nicht von Austrocknungseffekten. Im Gegensatz dazu bot die Lösung #3 einen gewissen Schutz vor Austrocknungsstress. * = p < 0,05 relativ zur Lösung #3 und s = p < 0,05 relativ zu unbehandelten (Kontroll-)Medien für die entsprechende Wiederherstellungszeit. Die Höhe des Balkens stellt den Mittelwert dar, und die Fehlerbalken sind die SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die schützende Wirkung von künstlichen Tränenlösungen gegen zellelige Austrocknung zu bestimmen. Zunächst werden die Zellen den trockenen Augentropfen ausgesetzt, um die Zellen zu beschichten. Als nächstes werden die Zellen getrocknet, und die metabolische Aktivität wird überwacht, um zu beurteilen, ob die Formulierungen die schädlichen Auswirkungen von Austrocknungsstress mildern können. Diese Schritte sind entscheidend für das Verständnis der Gesamtauswirkungen, die die Trockenaugenformulierungen auf die Gesamtlebensfähigkeit von Hornhautepithelzellen haben könnten.

Nachdem die meisten Formulierungen des trockenen Auges aus den Kulturbrunnen entfernt wurden, wirkt sich die Chemie der verbleibenden Moleküle, die mit den Zellen in Kontakt sind, auf die Zellaustrocknung aus. Einige Produkte enthalten Mikroemulsionen von Ölen, die die Zellverdunstung minimieren²⁰. Eine Studie, die Reibungsanalyse nach dem Spülen bewertet zeigte Die Aufrechterhaltung der niedrigen Reibung für einige trockene Augen Formulierungen, die ein Indikator für die verbesserte Verweilzeit der trockenen Auge Formulierungen²¹sein kann. Eine der Einschränkungen dieses Assays besteht darin, dass der Austrocknungsschutz zwar im Vergleich zu anderen Augentropfenformulierungen bewertet werden kann, die Dauer dieses Schutzes aufgrund der kurzen untersuchten Trocknungszeit jedoch nicht bestimmt werden kann. Längere Trocknungszeiten in diesem In-vitro-Test können die Verwendung von Mehrschichtkulturen erfordern, die insgesamt mehr Feuchtigkeitsgehalt haben als eine Zellmonoschicht.

Die spezifischen Inkubationszeiten für die Formulierungen an den Zellen und die Dauer der Trocknungszeit müssen möglicherweise angepasst werden, wenn Temperatur- und Feuchtigkeitswerte geändert werden. Die Auswahl einer Temperatur, eines RH und eines Luftstroms zur Simulation von Umgebungsstressbedingungen, die zu trockenem Auge beitragen können, kann schwierig sein, da die saisonalen und lokalen Umweltbedingungen recht variabel sind²¹. Moderne Umweltkammern für Humanstudien können die Temperatur zwischen 5 °C und 35 °C und RH zwischen 5% und 95%²²variieren. Mit Hilfe eines Verdampfers und einer eng montierten Brille wurde festgestellt, dass bei RH von 40 bis 45 % die Verdunstungsrate aus der Hornhaut 0,037 l/cm²/min betrug und bei RH von 20 bis 25 % die Verdampfungsrate 0,065 l/cm²/min^{23 betrug.} Wenn das In-vitro-Modell die schützende Wirkung von Formulierungen unter extrem niedrigen RH-Bedingungen wie in Flugzeugen^15,Wüsten oder trockenen Innenräumen¹⁶betrachtet, müssen die Inkubationszeiten möglicherweise reduziert werden, um die verbesserten Verdunstungsraten aus den Zellen zu berücksichtigen. In der menschlichen Tränenflüssigkeit sind eine Vielzahl von Lipiden aus Meibomian und anderen Drüsen vorhanden, die die Tränen vor Verdunstung schützen. Diese Lipide haben unterschiedliche Schmelzpunkte²⁴. Temperaturänderungen könnten sich auf die Fließfähigkeit der Tränenflüssigkeit auswirken, sodass Tests, die bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden, deutlich andere Verdampfungsraten aufweisen können als Tests, die bei 37 °C durchgeführt wurden. Da der durchschnittliche Temperaturbereich der Augenoberfläche zwischen 32,9 und 36 °C²⁵liegt, wird empfohlen, den Test in der Nähe dieses Temperaturbereichs durchzuführen.

Zusätzlich zu dem metabolischen Farbstoff (alamarBlue), der in diesem Protokoll verwendet wird, gibt es andere chemische Reagenzien, die verwendet werden können, um die Auswirkungen von Produktformulierungen auf die stoffwechselaktivität der Zelle zu bewerten. Die Tetrazoliumsalze (MTT, XTT, MTS, WST) sind alternative Chemikalien, die verwendet werden können. Der Unterschied in den Tetrazoliumsalzen ist, dass MTT ein positiv geladenes Molekül ist, so dass es in das Zytoplasma lebender Zellen eindringen kann²⁶. MTT wird nach seiner Reduktion durch NAD(P)H²⁷unlöslich. Es muss vor dem Lesen der Absorption auf einem Plattenleser slubilisiert werden. Die anderen Tetrazoliumsalze sind negativ geladen²⁸. Sie müssen durch sekundäre Moleküle außerhalb der lebenden Zelle reduziert werden, da sie nicht in die Zelle eindringen und direkt mit intrazellulären Molekülen interagieren²⁹. Für die XTT-, MTS- und WST-1-Assays kann die Zugabe eines Elektronenkopplungsmittels 1-Methoxyphenazin-Methosulfat (PMS) die Leistung der Assays³⁰verbessern. Im Gegensatz zu den metabolischen Assays, die Tetrazoliumsalze verwenden, benötigt alamarBlue keine zusätzlichen Löslichkeits- oder Elektronenkopplungsmittel. Auch im Gegensatz zu XTT, MTS oder WST-1 dringt alamarBlue in Zellmembranen ein und kann direkt durch Zellenzyme²⁷^,²⁹reduziert werden. Der direkte Vergleich von alamarBlue mit Tetrazoliumsalzen hat gezeigt, dass alamarBlue empfindlicher für die Bewertung der Stoffwechselaktivität verschiedener Zelllinien, einschließlich HCEC³^,²⁷^,³¹^,³²ist.

Andere biochemische Endpunkte können auch für die Bewertung des Schutzes menschlicher Hornhautepithelzellen durch Austrocknung in Betracht gezogen werden. Fluoreszierende Farbstoffe können verwendet werden, um Zellmembrandurchlässigkeit und Zellesteraseaktivität zu erkennen¹. Auch kann Apoptose durch Färbung für apoptotische Marker auf der Zelloberfläche oder durch Messung für Caspase-Aktivität¹^,³³erkannt werden. Andere Assays haben die Auswirkungen von ophthalmologischen Produkten auf HCEC-Engstellen bestimmt³⁴. Diese Assays könnten in zukünftige Bewertungen unter Verwendung der in diesem Artikel beschriebenen Austrocknungsverfahren einbezogen werden.

Es gibt viele Ursachen für trockenes Auge. Trockenes Auge kann durch verminderte Sekretion von Rissen, erhöhte Augenoberflächenentzündung oder erhöhte Dehydrierung an der Augenoberfläche verursacht werden. Für die Personen, die verdunstende trockene Augen Verwendung eines trockenen Augentropfens, der verhindert, dass ihre Zellen während der Austrocknung Bedingungen zu trocknen kann die Symptome des trockenen Auges zu lindern. Eines der Probleme bei einigen trockenen Augen Formulierungen ist das Vorhandensein von Konservierungsstoffen, die die Augenoberfläche schädigen können. Die Verletzung von Zellen ist nicht hilfreich, um Augenpatienten zu trocknen, da es dazu führen kann, dass mehr Zellen sterben, da verletzte Zellen anfälliger für Austrocknungsstress sind³⁵.

Ein aktueller Review-Artikel von Garrigue et al.³⁶ gibt eine Einschätzung der aktuellen Erkenntnisse darüber, wie lipidbasierte Produkte wirken, um verdunstende trockene Augen zu lindern. Das Hinzufügen von Lipiden zu lipidarmen Tränen kann verdunsten verhindern und so die Zellen vor Austrocknung schützen. Darüber hinaus sind Feuchthaltemittel Moleküle, die Wasser an der Augenoberfläche anziehen und zurückhalten³⁷. Sowohl Glycerin in Lösung #1 als auch Propylenglykol in Lösung #3 sind Feuchthaltemittel. Lösung#3 zeigten eine größere Schutzwirkung des HCEC, die möglicherweise auf die Lipid- und Feuchthaltemitteleigenschaften der Formulierungsbestandteile zurückzuführen ist.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die metabolische Aktivität von HCEC nach Exposition gegenüber den trockenen Augenformulierungen und der Austrocknungsbelastung zu bewerten. Durch die Verwendung der in diesem Artikel beschriebenen Methoden können neue nicht irritierende und schützende Augentropfen für Menschen entwickelt werden, die unter verdunstendem trockenem Auge leiden.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Alcon für die finanzielle Unterstützung dieser Studien.

Materials

75 cm² Vented Flask	Corning	354485	This is the BioCoat brand collagen coated
96 well plate	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Corning 48 Well plates	Corning	354505	This is the BioCoat brand collagen coated
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590)
DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES	Gibco	11039-021	There is No Phenol Red in this media
Fetal Bovine Serum	Hycone	SH30396.03
Human Corneal Epithelial Cells	University of Ottawa	N/A	SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72.
Humidity/Temperature Chamber	Associated Environmental Systems	LH-1.5	Economy Line Humidity Chamber
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	100X concentration so add 1ml to each 99ml of media
Refresh Optive Advanced (solution #1)	Allergan, Inc		Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH.
Soothe XP (solution #2)	Bausch & Lomb		Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH).
Systane Complete (solution #3)	Alcon Inc.		Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH.
TrypLE Express (cell disassociation solution)	Fisher Scientific	12605036

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Corneal Epithelial Cells Desiccation Artificial Tear Formulations Metabolic Activity Cell Culture Cell Viability Assay Fluorescence Measurement

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Rangarajan, R., Ketelson, H. A., Do, R., McCanna, D. J., Suko, A., Enstone, D., Subbaraman, L. N., Dantam, J., Jones, L. W. Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation. J. Vis. Exp. (159), e60812, doi:10.3791/60812 (2020).