건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활동에 인공 눈물 제형의 효과
Özet
이 프로토콜의 목적은 다른 인공 눈물 제형이 체외 모델을 사용하여 건조로부터 인간의 각막 상피 세포를 보호 할 수 있는지 평가하는 것입니다. 인공 눈물 제형 및 탈수에 노출 된 후, 인간 각막 상피 세포는 대사 활성을 위해 평가됩니다.
Abstract
결핍된 눈물 지질 층의 복원에 의한 눈물 증발을 줄이기 위해 인공 지질 함유 눈물 제형이 개발된다. 세포 탈수를 방지하는 인공 눈물 제형은 안구 표면 보호 및 세포 대사 활동의 유지 를 초래할 것이다. 탈수 하는 동안, 세포 신진 대사 활동의 손실 및 이후 세포 죽음의 과정을 겪고. 이 작품은 인공 눈물 제형의 효능을 평가하는 방법을 설명합니다. 대사 염료 (즉, alamarBlue)는 낮은 형광 분자 resazurin에서 실행 가능한 세포에서 형광 분자 resorufin로 변경됩니다. 인공 눈물 제형의 생물학적 성능은 (a) 세포 생존가능성을 유지하고 (b)가 탈수로부터 세포 보호를 제공하는 제형의 능력으로 측정된다. 성장 매체와 식염수는 세포 생존/탈수 검사에 대한 컨트롤로 사용됩니다. 세포는 30분 동안 테스트 용액으로 배양한 다음 37°C에서 0 또는 5분 및 상대 습도 45%로 건조됩니다. 세포 대사 활동은 초기 노출 후 및 세포 건조 후 결정된다. 결과는 세포 대사 활동 및 탈수 보호에 안약 제형의 비교 효력을 보여줍니다. 이 방법은 증발 성 안구 건조증을 가진 개별을 취급하도록 디자인된 안구 건조제 제형을 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
다용량 안과 용액의 많은 다른 성분은 안정성, pH, 발진 및 효능을 유지하기 위해 필요합니다. 그러나, 안구 솔루션에서 방부제 또는 계면활성제와 같은 일부 화학 물질은 각막 상피1,2에손상을 일으킬 수 있다. 인간 각막 상피 세포(HCEC)를 이용한 세포 생존성 테스트는 안과 제제에서 이러한 다양한 성분에 의한 잠재적 손상을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 세포 손상을 평가하는 데 특히 유용한 체외 분석 중 하나는 alamarBlue 분석3이다. 이 분석에서, 대사 염료 (즉, alamarBlue)는 세포 생존 성 지표로 작동하는 레사쥐린을 포함합니다. 세포 호흡 동안, 레사쥐린은 전자4를받아들이면 레스소루핀으로 감소된다. 레소루핀의 감소는 비형광 분자에서 분광성계5를사용하여 검출될 수 있는 형광 분자로의 변화를 일으킨다.
이 조사는 각막 상피 세포의 2개의 다른 처리를 사용하여 안구건조구건조기 제품이 체외 모형에서 어떻게 능력을 발휘할 수 있는지 결정하기 위하여. 첫 번째 평가에서, 세포는 30 분 동안 이러한 제품으로 처리된다. 치료 후, 세포는 안구건조건조건조제품에 노출된 직후와 회복 시간 간격 이후에 대사 활성을 평가한다. 이 평가는 습도 챔버에서 건조하기 전에 세포에 이러한 제품의 효과를 결정합니다. 이러한 솔루션에서 용액 방부제, 계면 활성제 또는 완충제는 대사 염료를 사용하여 검출될 수 있는 세포에 약간의 세포독성 효과가 있을 수 있다.
두 번째 평가는 안구건조에 노출된 후 세포의 대사 활성을 결정한다. 이 평가에서, 제품 치료가 탈수 손상으로부터 세포에 대한 보호를 제공하는 경우, 세포의 대사 활성은 유지될 것이다. 건조의 유해한 영향으로부터 세포 보호는 안구 건조의 유해한 영향으로부터 발생하거나 제품이 세포에 수분을 추가하는 주변환경으로부터 액체를 흡수할 수 있는 경우 발생할 수 있다.
이 프로토콜은 세포에 대한 환경 스트레스의 심각한 조건을 시뮬레이션하도록 설계되었습니다. 다른 연구는 이 외부 응고를 만들기 위하여 각종 모형을 이용했습니다. 일부 연구는 라미나르 유동 후드6,7,8에서세포를 건조한 반면, 다른 연구는 실온 및 다양한 상대 습도(RH) 값을9,10,11로사용했다. 안구건조증 상태를 시뮬레이션하는 방법은 인큐베이팅용액(12,13)의진동을 증가시키는 것이다. 불리한 환경 조건을 시뮬레이션하기 위한 또 다른 체외 방법은 안구건조증 환자의 눈물액을 시뮬레이션하기 위해 세포 매체에 사이토카인을 첨가하여14. 이 시험은 화학 물질이 삼투압응을 감소시키는 방법을 평가하거나 면역 계통을 자극할 수 있는 흥미로운 모형이지만, 이 모형은 화학 제형이 탈수 긴장에서 세포를 보호할 수 있는 방법을 직접 보여주지 않습니다.
탈수 모델은 온도/습도 챔버 37°C 및 45% RH를 사용합니다. 안구 표면에서 증발을 일으킬 수 있는 환경 조건을 시뮬레이션합니다. 비행기캐빈(15)이나 겨울철 실내 환경에서 발견되는 습도가 낮거나16년 동안 실내 환경에서 발견되는 다른 극단적인 환경 조건의 시뮬레이션도 이 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다.
세포 배양 모델링은 인간 각막에 대한 건조 응력의 효과를 시뮬레이션하는 데 사용됩니다. 세포 스트레스를 감지하기 위해 세포 생존 가능성 테스트는 세포 건강에 미치는 영향을 결정하기 위해 수행됩니다. 몇몇 다른 생리학적 시험은17의스트레스를 받는지 결정하기 위하여 세포에 수행될 수 있습니다. 이 시험 절차에서 수행된 분석은 시판되는대사염(재료표)을 사용한다. 그것은 비 독성, 성장 매체에 용해하고 세포 고정없이 세포를 평가 할 수 있다는 점에서 많은 다른 세포 스트레스 테스트에 비해 장점을 갖는다18. 이 절차에서 세포는 각 치료 직후 대사 활성을 테스트하고 두 번째 세포 세트는 성장 매체로 다시 배치되고 18 h 회복 후 평가됩니다. 회복 기간 이후에 즉시 테스트하는 이유는 대사 활동과 지연된 효과를 유발하는 세포 손상에 즉각적인 영향을 미치는 세포 손상을 식별하기 때문입니다. 또한, 이러한 제제가 단기 대 장기 손상에 미치는 영향과 초기 모욕으로부터 복구/복구하지 않는 제제의 능력을 평가할 수 있는 기회를 제공한다.
이 조사는 건조유무의 HCEC 대사 활동에 미치는 영향에 대해 다양한 지질 함유 안구건조증 제품을 비교하는 데 사용됩니다. 테스트된 안구건조기 제품의 성분은 재료표에기재되어 있다. 용액 #1 성분은 카복티메틸셀룰로오스 나트륨(0.5%), 글리세린(1%), 폴리소르바테 80(0.5%), 용액#2 광광유(1.0%) 및 미네랄 오일(4.5%)과 용 #3액에서 지질은 미네랄 오일과 프로필렌 글리콜이 데물입니다. 이러한 지질은 건조로부터 HCEC의 보호를 제공할 것으로 예상되는 제형 성분이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 세포 건조에 대한 인공 눈물 용액의 보호 효과를 결정하도록 설계되었습니다. 처음에 세포는 세포를 코팅하기 위해 안구 안약에 노출됩니다. 다음으로, 세포는 건조되고, 대사 활성은 제형이 탈수 스트레스의 해로운 효과를 완화할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 모니터링된다. 이 단계는 안구건조기 제형이 각막 상피 세포의 전반적인 생존가능성에 미칠 수 있는 전반적인 충격을 이해하는 데 중요합니다.
대부분의 안구건조건조제가 배양 우물에서 제거된 후, 세포와 접촉하는 나머지 분자의 화학은 세포 건조에 영향을 미칩니다. 일부 제품에는 세포 증발을 최소화하는 오일의 미세에멀젼(20)이포함되어 있습니다. 헹구기 후 마찰 분석을 평가한 연구는 안구건조증제형(21)의주거 시간을 나타내는 지표가 될 수 있는 일부 안구건조증 제형에 대한 낮은 마찰유지를 보여주었다. 이 분석의 한계 중 하나는 탈수 보호가 다른 안약 제형에 비해 평가될 수 있지만 이 보호의 지속 기간은 짧은 건조 시간 으로 인해 결정될 수 없다는 것입니다. 이 시험관 내 분석에서 건조 시간이 길어지면 세포 단층보다 전반적으로 수분 함량이 더 많은 다층 배양을 사용해야 할 수 있습니다.
세포상제형에 대한 구체적인 배양 시간 및 건조 시간의 지속 시간은 온도 및 습도 값이 변경될 경우 조정될 필요가 있을 수 있다. 안구건조증에 기여할 수 있는 환경스트레스 조건을 시뮬레이션하기 위한 온도, RH 및 공기 흐름을 선택하는 것은 계절및 지역 환경 조건이 매우 가변적이기 때문에 어려울 수있다. 인간 연구를 위한 현대환경챔버는 5°C와 35°C, RH 사이의 온도를 5%에서 95%22사이로변화시킬 수 있다. 증발계와 단단히 장착된 고글을 사용하여 40-45%의 RH에서 각막으로부터의 증발율은 0.037 μL/cm2/min및RH 20-25%로 증발율은 0.065 μL/cm2/min23이었다. 시험관내 모델이비행기(15),사막, 또는 건조한 실내환경(16)과같은 매우 낮은 RH 조건하에서 제형의 보호 효과를 보고 있는 경우, 인큐베이션 시간은 세포로부터의 향상된 증발속도를 수용하기 위해 감소될 필요가 있다. 인간의 눈물액에서, 메이보미안과 다른 땀샘에서 파생된 다양한 지질이 존재하여 증발로부터 눈물을 보호합니다. 이 지질은 다른 융점24를가지고 있습니다. 온도 변화는 눈물 액의 유동성에 영향을 미칠 수 있으므로 주변 온도에서 수행 된 테스트는 37 °C에서 수행 된 테스트보다 크게 다른 증발 속도를 가질 수 있습니다. 평균 안구 표면 온도 범위는 32.9 ~ 36°C25이기때문에, 이 온도 범위 근처에서 시험을 수행하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜에 사용되는 대사 염료(alamarBlue) 외에도 세포 대사 활동에 대한 제품 제형의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있는 다른 화학 시약이 있다. 테트라졸륨 염(MTT, XTT, MTS, WST)은 사용할 수 있는 대체 화학물질입니다. 테트라졸륨 염의 차이는 MTT가 양전하 분자이므로 살아있는세포(26)의세포질에 들어갈 수 있다는 것입니다. MTT는 NAD(P)H27에의한 감소 후 용해되지 않게 된다. 플레이트 판독기에서 흡광도를 읽기 전에 용해성화되어야 합니다. 다른 테트라졸륨 염은28로음하로 충전된다. 그(것)들은 세포를 입력하고 세포 내 분자(29)와직접 상호 작용할 수 없기 때문에 살아있는 세포 외부의 이차 분자에 의해 감소되어야 합니다. XTT, MTS 및 WST-1 아세의 경우 전자 커플링 에이전트 1-메톡시 페나진 메토술페이트(PMS)를 첨가하면아세서(30)의성능을 향상시킬 수 있다. tetrazolium 염을 사용 하는 대사 assays와는 달리, alamarBlue 추가 용용 또는 전자 커플링 에이전트를 필요로 하지 않습니다. 또한, XTT, MTS 또는 WST-1과 달리, alamarBlue는 세포막을 관통하고 세포효소(27,29)에의해 직접 감소될 수 있다. alamarBlue를 테트라졸륨 염에 직접 비교한 결과, AlamarBlue는 HCEC3,27,31,32등 다양한 세포주의 대사 활성을 평가하기 위해 더 민감하다는 것을 보여주었다.
다른 생화학적 종점은 또한 탈수에 의한 인간 각막 상피 세포의 보호를 평가하기 위한 고려될 수 있습니다. 형광염염료는 세포막 투과성 및 세포 에스트라아제 활성1을검출하는 데 사용될 수 있다. 또한, 세포 표면에 세포 표면에 석멸 마커에 대한 염색또는 카스파제 활성1,33을측정함으로써 세포 세포 에 스테인싱하여 세포 세포증을 검출할 수 있다. 다른 assays는 HCEC 꽉 접합34에안과 제품의 효과를 결정했다. 이러한 논문은 이 문서에 설명된 탈수 절차를 활용하여 향후 평가에 포함될 수 있습니다.
안구건조증의 원인은 여러 가지가 있습니다. 안구 건조증은 눈물의 분비 감소, 안구 표면 염증 증가 또는 안구 표면의 탈수 증가로 인해 발생할 수 있습니다. 건조 조건 동안 건조에서 그들의 세포를 방지 하는 안구 건조 방울의 증발 안구건조증 사용 이 개인에 대 한 안구 건조의 증상을 완화수 있습니다. 일부 안구 건조증 제제의 문제 중 하나는 안구 표면에 해를 끼칠 수 있는 방부제의 존재입니다. 부상당한 세포가 탈수 스트레스(35)에더 취약하기 때문에 더 많은 세포가 죽을 수 있으므로 세포를 손상시키는 것은 안구 건조 환자에게 도움이되지 않습니다.
Garrigue 외.36에 의해 최근 검토 기사는 지질 기반 제품이 증발 안구건조증을 완화하기 위해 어떻게 작용하는지에 대한 현재의 지식의 평가를 제공합니다. 지질 결핍 눈물에 지질을 추가하면 증발을 방지 할 수 있으므로 세포가 건조로부터 보호됩니다. 또한, 군수제는 안구표면(37)에서물을 유치하고 유지하는 분자이다. 용액 #1 글리세린과 용액의 프로필렌 글리콜 #3 모두 부추관입니다. 용액 #3 제형 성분의 지질 및 후유성 특성 때문일 수 있는 HCEC의 더 큰 보호 효과를 보였다.
이 프로토콜은 안구건조증 제형에 노출된 후 HCEC의 대사 활성을 평가하고 건조 스트레스를 평가하도록 설계되었습니다. 이 문서에 설명된 방법을 사용하여 증발성 안구건조증을 앓고 있는 사람들을 위해 새로운 비자극성 및 보호 점안액을 개발할 수 있습니다.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이러한 연구에 대 한 재정 지원을 제공 하는 알콘 감사.
Materials
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
| DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES | Gibco | 11039-021 | There is No Phenol Red in this media |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72. |
| Humidity/Temperature Chamber | Associated Environmental Systems | LH-1.5 | Economy Line Humidity Chamber |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100X concentration so add 1ml to each 99ml of media |
| Refresh Optive Advanced (solution #1) | Allergan, Inc | Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH. | |
| Soothe XP (solution #2) | Bausch & Lomb | Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH). | |
| Systane Complete (solution #3) | Alcon Inc. | Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH. | |
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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