Измерение эритроцитов дополнение рецептор ато 1 Использование потока цитометрии

CR1 (дополнение рецептора типа 1, CD35) является 200 kDa трансмембранного гликопротеина присутствует на поверхности многих типов клеток, таких как эритроциты¹, B лимфоцитов², моноцитные клетки, некоторые Т-клетки, фолликулярные дендритные клетки³, фетальные астроциты⁴, и glomerular podocytes⁵. CR1 вмешиваясь в его лиганды C3b, C4b, C3bi^6,,7,,8,9, подразделение первого компонента дополнения, C1q¹⁰ и MBL (манна-связывающий лектин)¹¹ подавляет активацию дополнения и участвует в гуморальном и клеточном иммунном ответе.

У приматов, в том числе людей, эритроцит CR1 участвует в транспортировке иммунных комплексов в печень и селезенку, очищает кровь и предотвращает их накопление в уязвимых тканях, таких как кожа или почки^12,13,14. Это явление иммунной адгезии между иммунными комплексами и эритроцитами зависит от количества молекул CR1^15. У человека средняя плотность CR1/E составляет всего 500 (т.е. 500 молекул CR1 на эритроцит). Эта плотность варьируется от одного человека к другому (100-1200 CR1/E) и от одного эритроцита к другому в том же человеке. Некоторые лица “нулевой” фенотип выразить менее 20 CR1/E¹⁶.

Плотность CR1/E регулируется двумя содоминирующими аутосомными аллелями, связанными с точечной мутацией в интронном 27 кодирования гена для CR1’1^17,18. Эта мутация создает дополнительный узел ограничения для фермента HindIII. Фрагменты ограничения, полученные после пищеварения с HindIII в данном случае 7,4 кб для аллеля, связанного с сильным выражением CR1 (H: high allele) и 6,9 кб для аллеля, связанного с низким выражением CR1 (L: низкий аллель). Эта связь встречается у кавказцев и азиатов, но не у людей африканского происхождения¹⁹.

Уровень экспрессии эритроцита CR1 также коррелирует с наличием точечных нуклеотидных мутаций в экзоне 13 кодирования SCR 10 (I643T) и в экзоне 19 кодирования SCR16 (981H). Он высок в гомозиготных 643I/981 “и низкий в гомозиготных 643T/981H лиц²⁰. Таким образом, “низкие” лица выражают около 150 CR1/E, “средние” лица выражают около 500 CR1/E, а “высокие” лица выражают около 1000 CR1/E.

В дополнение к этому полиморфизму плотности эритроцита, CR1 характеризуется полиморфизмом длины, соответствующим четырем аллотипам разных размеров: CR1’1 (190 kDa), CR1’2 (220 kDa), CR1’3 (160 kDa) и CR1’4 (250 kDa)²¹ и антигенийский антигенный^{антигенистый антигенный антигенный антиген.}

Мы представляем наш метод, основанный на цитометрии потока, чтобы определить плотность CR1/E. Используя три предмета, плотность которых известна как CR1/E, выражая низкий уровень плотности (180 CR1/E), средний уровень плотности (646 CR1/E), и высокий уровень плотности (966 CR1/E), легко измерить среднюю интенсивность флуоресценции (МФИ) их эритроцитов или красных кровяных телец (РБК) Затем можно построить стандартную линию, представляющую МФО в зависимости от плотности CR1/E. Измеряя МФО субъектов, плотность CR1/E не известна, и сравнивая ее с этой стандартной линией, можно определить плотность CR1/E. Этот метод был использован в течение многих лет в лаборатории, и позволило нам обнаружить снижение экспрессии эритроцитов CR1 во многих патологиях, таких как системная волчанка эритематоза (СКВ)²³, Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД)²⁴, малярия²⁵, и недавно болезнь Альцгеймера (AD)^26,27. Разработка препаратов, нацеленных на CR1 в паре с эритроцитами, как и в случае антитромботических препаратов²⁸ требует оценки плотности CR1/E, а также наличия надежной техники количественной оценки CR1.

Представленный протокол проходит в singlicate. Он адаптируется для определения плотности CR1/E на многих людей, использующих конкретные коммерчески доступные 96 пластин скважин (см. Таблицу Материалов). С этой целью, это легко адаптировать наш метод к любой 96 хорошо пластины. Для каждого образца на один колодец распределяется клеточная суспензия эритроцитов (0,5 х 10⁶-1 х 10⁶ эритроцитов). Для каждого колодца сначала добавляются первичные анти-CR1 антитела, затем стрептавидин ПЭ, вторичное антиорганизмы против стрептавидина, и снова стрептавидиновые ПЭ, использующие те же разбавления, что и наш метод, но путем адаптации объемов и соблюдения пропорциональности.

Образцы крови, взятые у субъектов диапазона и от предметов, которые должны быть количественно оценены для CR1, должны быть взяты в то же время, храниться в холодильнике при 4 градусах Цельсия и обрабатываться при 4 градусах Цельсия (на льду и/или в холодильнике).