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Özet
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İmmünoloji ve Enfeksiyon

유세포 분석을 사용하여 적혈구 보체 1 보체 측정

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/60810
, , , , ,
1Oncogeriatric Coordination Unit,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform,University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology,Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne

Özet

이 방법의 목적은 적혈구 CR1 밀도가 알려진 세 명의 피험체와 비교하여 임의의 적혈구에서 CR1 밀도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 피코에리트린(PE)을 사용하여 증폭된 시스템에 결합된 항 CR1 단일클론 항체에 의한 피험자의 적혈구의 면역 염색 후 유세포분석을 사용한다.

Abstract

CR1 (CD35, C3b/C4b를 위한 보체 수용체 타입 1)은 약 200 kDa의 고분자량 막 당단백질로, 활성화를 보완하고 면역 복합체를 운반하며 체액 및 세포 면역 반응에 참여합니다. CR1은 적혈구를 포함한 많은 세포 유형의 표면에 존재하며, 길이, 구조(Knops, 또는 KN, 혈액형) 및 밀도에서 다형성을 나타낸다. 적혈구 당 CR1의 평균 밀도 (CR1/E) 적혈구 당 500 분자입니다. 이 밀도는 한 개인에서 다른 (100-1,200 CR1/E)와 같은 개인의 적혈구에서 다른 사람까지 다양합니다. 우리는 증폭 면역 염색 시스템의 도움으로 낮은 밀도를 발현하는 과목을 포함하여 CR1/E의 밀도를 측정하는 견고한 유량 세포 분석 방법을 제시합니다. 이 방법은 알츠하이머 병 (AD), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 에이즈 또는 말라리아와 같은 질병에서 CR1 적혈구 발현의 저하를 보여줄 수있게했습니다.

Introduction

CR1(수용체 타입 1, CD35)은 적혈구1,B 림프구2,단핵세포, 일부 T 세포, 여포 수지상 세포3,태아 성상세포4,및 사구체 포세포5와같은 많은 세포 유형의 표면에 존재하는 200 kDa 막 막 당단백질이다. CR1은 리간드 C3b, C4b, C3bi6,,7,,88,9,제1 보체 성분의 소단위, C1q10 및 MBL(mannan-binding lectin)을 방해하여 보체 및 세포 면역 반응의 활성화를 억제한다.11

영장류에서, 인간을 포함하는 영장류에서, 적혈구 CR1은 간 및 비장으로 면역 복합체의 수송에 관여하며, 혈액을 정화하고 피부 또는 신장과 같은 취약한 조직에 그들의 축적을방지12,,13,,14. 면역 복합체와 적혈구 사이의 면역 접착의 이러한 현상은 CR1분자(15)의수에 따라 달라지다. 인간에서, CR1/E의 평균 밀도는 단지 500 (즉, 적혈구 당 CR1의 500 분자)입니다. 이 밀도는 한 개인에서 다른 (100-1,200 CR1/E)와 같은 개인의 적혈구에서 다른 사람까지 다양합니다. “null” 표현형의 일부 개인은 20 CR1/E16보다 적게 표현합니다.

CR1/E의 밀도는 CR1*117,,18에대한 코딩 유전자의 인트론 27에서 점 돌연변이에 연결된 2개의 공동 지배적인 상염색체 대두에 의해 조절된다. 이 돌연변이는 HindIII 효소에 대한 추가적인 제한 부위를 생성한다. 이 경우 HindIII로 소화한 후 얻어진 제한 단편은 CR1(H: 하이 알레일)의 강한 발현에 연결된 대문자에 대해 7.4 kb이고, 낮은 CR1 발현에 연결된 대문자에 대한 6.9 kb이다(L: 저알수). 이 링크는 백인과 아시아인에서 발견되지만 아프리카 혈통의 사람들에서는 발견되지 않습니다19.

적혈구 CR1의 발현 수준은 또한 엑소13 인코딩 SCR 10(I643T) 및 엑소온 19 인코딩 SCR16(Q981H)에서 점 뉴클레오티드 돌연변이의 존재와 상관된다. 그것은 동형 접합 643I / 981Q에서 높고 동형 접합 643T / 981H 개인20에서낮습니다. 따라서, “낮은” 개별은 약 150 CR1/E를 표현하고, “매체” 개별은 약 500 CR1/E를 표현하고, “높은” 개별은 약 1,000 CR1/E를 표현합니다.

이 적혈구 밀도 다형성 이외에, CR1은 서로 다른 크기의 네 개의 allotype에 해당하는 길이 다형성을 특징으로합니다 : CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), CR1 * 4 (250 kDa) 및 항원 다형성21 및 항원 다형성21.

우리는 CR1/E의 밀도를 결정하기 위해 유동 세포측정법을 기반으로 하는 방법을 제시합니다. CR1/E 밀도가 알려진 3명의 피험자를 사용하여 저밀도 수준(180 CR1/E), 중간 밀도 수준(646 CR1/E), 고밀도 수준(966 CR1/E)을 발현하여, 면역항혈투모 또는 RBC-CR1 을 이용한 적혈구 또는 적혈구(RBC) 또는 RBC MFI의 평균 형광 강도(MFI)를 측정하기 가 용이하다. 그런 다음 CR1/E 밀도의 함수로 MFI를 나타내는 표준 선을 플롯할 수 있습니다. CR1/E 밀도가 알려지지 않은 피험자의 MFI를 측정하여 이 표준 선과 비교하여 개인의 CR1/E 밀도를 결정할 수 있습니다. 이 기술은 실험실에서 수년 동안 사용되어 왔으며, 전신 성 홍반성 루푸스 (SLE)23,후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)24,말라리아25,최근 알츠하이머 병 (AD)26, 27과같은 많은 병리학에서 적혈구 CR1의 발현 감소를 검출 할 수있게되었습니다.26, 항혈전성약물(28)의 경우와 같이 적혈구와 결합하여 CR1을 표적으로 하는 약물의 개발은 CR1/E 밀도의 평가, 및 CR1을 정량화하는 견고한 기술의 가용성을 필요로 한다.

제시된 프로토콜은 싱글리케이트에서 실행됩니다. 상업적으로 이용 가능한 96개의 웰 플레이트를 사용하는 많은 개인에 대한 CR1/E의 밀도를 결정하는 데 적합합니다(재료 표참조). 이를 위해 96 웰 플레이트에 당사의 방법을 쉽게 조정할 수 있습니다. 각 견본을 위해, 적혈구의 세포 현탁액 (0.5 x 106 -10 06 적혈구)는 잘 당 분포됩니다. 각 우물을 위해, 첫째로 1 차적인 반대로 CR1 항체가 추가되고, 그 다음 streptavidin PE, 이차 항 스트렙타비딘 항체, 그리고 다시 스트렙타비딘 PE, 우리의 방법의 것과 동일한 희석을 사용하여, 그러나 양을 적응하고 비례를 존중해서.

CR1에 대해 정량화될 범위의 피험자 및 피험자의 혈액 샘플을 동시에 그려서 4 °C에서 냉장고에 보관하고 4 °C (얼음 및 / 또는 냉장고에서)에서 처리해야합니다.

Protocol

인간의 혈액 수집 및 취급을 위한 프로토콜은 지역 윤리 위원회 (CPP Est II)에 의해 검토되고 승인되었으며, 프로토콜 번호는 2011-A00594-37입니다. 다음 의정서는 인간의 혈액 의학적 처리를 설명하기 때문에 생체 유해 물질 의 폐기에 대한 제도적 지침을 따라야 합니다. 실험실 코트와 장갑과 같은 실험실 안전 장비는 착용해야 합니다. 1. 적혈구 세척 참고: 취?…

Representative Results

CR1의 밀도가 알려진 3명의 피험자의 적혈구(“낮음” 대상 [180 CR1/E], “중간” 대상 [646 CR1/E], 및 “높음” 대상 [966 CR1/E]), 그리고 CR1 밀도가 결정되어야 하는 2명의 피험자의 항 CR1 항체결합을 사용하여 증폭계에 면역으로 염색하였다. 처음에, 낮은 고범위로부터 피험자의 CR1 밀도는 방사성 표지된 항체를 이용한 Scatchard 방법29에 의해 결정되었다. 결정된 표준(낮음, 중간 및 높음)은 교정 …

Discussion

적혈구 CR1 (CR1/E)의 밀도를 결정하기 위해 몇 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 사용된 첫번째 기술은 항 CR1항체(31)에 의한 적혈구의 응집 및 C3b32로코팅된 적혈구의 존재 에 있는 장미의 대형이었습니다. 이러한 기초적인 기술은 방사성 표지된 항 CR1 항체1,,33을사용하여 면역 염색 방법으로 빠르게 대체되었다. 또한 ?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 URCACyt의 모든 구성원, 유동 세포 분석 기술 플랫폼, 면역학의 부서의 직원, 그리고 프로토콜을 최적화하고 검증하는 데 기여 한 내과 및 노인학과의 직원에게 감사드립니다. 이 작품은 랭스 대학 병원에 의해 투자되었다 (보조금 번호 AOL11UF9156).

Materials

1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook immunostaining
Blouse protection
Bovin serum albumin (7,5%) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 15260037 cytometry
Centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 11176917 centrifugation
Clean Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340345 cytometry
Comorack-96 Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 944060P rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 655051 cytometry
Formaldehyde solution 36.5 % Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France F8775-25ML Fixation
10 µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 647788 cytometry
Microman Capillary Pistons Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 067494 sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath MP32051 mix
Micropipette Microman – type M25 – Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 066379 sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10010031 cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 391952 sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
Rinse Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340346 cytometry
Round bottom tube Sarstedt, F-70150 Marnay, France 55.1579 cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
streptavidin R-PE Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France AS-60669 immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10203001 mix
Vector anti streptavidin biotin Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France BA-0500 immunostaining
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix
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Referanslar

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ErythrocyteComplement Receptor 1Flow CytometryCell Receptor DensityImmunostainingBiotinylated AntibodyStreptavidin Phycoerythrin

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Kisserli, A., Audonnet, S., Duret, V., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Mahmoudi, R. Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e60810, doi:10.3791/60810 (2020).
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