Messung des Erythrozytenkomplementrezeptors 1 mit Durchflusszytometrie
Özet
Das Ziel dieser Methode ist es, die CR1-Dichte in den Erythrozyten eines jeden Probanden zu bestimmen, indem man mit drei Probanden vergleicht, deren Erythrozyten-CR1-Dichte bekannt ist. Die Methode verwendet Durchflusszytometrie nach Immunfärbung der Erythrozyten der Probanden durch einen monoklonalen Anti-CR1-Antikörper, der mit einem verstärkten System mit Phycoerythrin (PE) gekoppelt ist.
Abstract
CR1 (CD35, Komplementrezeptor Typ 1 für C3b/C4b) ist ein hochmolekulares Membranglykoprotein von etwa 200 kDa, das die Komplementaktivierung steuert, Immunkomplexe transportiert und an humoralen und zellulären Immunreaktionen teilnimmt. CR1 ist auf der Oberfläche vieler Zelltypen vorhanden, einschließlich Erythrozyten, und weist Polymorphismen in Länge, Struktur (Knops oder KN, Blutgruppe) und Dichte auf. Die durchschnittliche Dichte von CR1 pro Erythrozyten (CR1/E) beträgt 500 Moleküle pro Erythrozyten. Diese Dichte variiert von Individuum zu Individuum (100–1.200 CR1/E) und von einem Erythrozyten zum anderen in demselben Individuum. Wir präsentieren hier eine robuste Durchflusszytometrie-Methode zur Messung der Dichte von CR1/E, auch bei Probanden, die eine geringe Dichte ausdrücken, mit Hilfe eines amplifizierenden Immunstainierungssystems. Diese Methode hat es uns ermöglicht, die Senkung der CR1-Erythrozytenexpression bei Krankheiten wie Alzheimer (AD), systemischem Lupus erythematodes (SLE), AIDS oder Malaria zu zeigen.
Introduction
CR1 (Komplementrezeptor Typ 1, CD35) ist ein 200 kDa Transmembran-Glykoprotein auf der Oberfläche vieler Zelltypen, wie Erythrozyten1, B-Lymphozyten2, monozytäre Zellen, einige T-Zellen, follikuläre dendritische Zellen3, fetale Astrozyten4und glomeruläre Podozyten5. CR1 stört seine Liganden C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, eine Untereinheit der ersten Komplementkomponente, C1q10 und MBL (mannan-binding lectin)11 hemmt die Aktivierung der Komplementierung und ist an der humoralen und zellulären Immunantwort beteiligt.
Bei Primaten, einschließlich Menschen, ist Erythrozyten CR1 am Transport von Immunkomplexen zur Leber und Milz beteiligt, um das Blut zu reinigen und ihre Ansammlung in empfindlichen Geweben wie der Haut oder den Nieren zu verhindern12,13,14. Dieses Phänomen der Immunhaftung zwischen Immunkomplexen und Erythrozyten hängt von der Anzahl der CR1-Moleküle15ab. Beim Menschen beträgt die mittlere Dichte von CR1/E nur 500 (d.h. 500 Moleküle von CR1 pro Erythrozyten). Diese Dichte variiert von Individuum zu Individuum (100–1.200 CR1/E) und von einem Erythrozyten zum anderen in demselben Individuum. Einige Personen des “Null”-Phänotyps drücken weniger als 20 CR1/E16aus.
Die Dichte von CR1/E wird durch zwei ko-dominante autosomale Allele reguliert, die mit einer Punktmutation in Intron 27 des Genkodierungsmittels für CR1*117,18verbunden sind. Diese Mutation erzeugt eine zusätzliche Restriktionsstelle für das HindIII-Enzym. Die Restriktionsfragmente, die nach der Verdauung mit HindIII erhalten wurden, sind 7,4 kb für das Allel, das mit einem starken Ausdruck von CR1 (H: hohes Allel) verbunden ist, und 6,9 kb für das Allel, das mit einem niedrigen CR1-Ausdruck verbunden ist (L: niedriges Allel). Diese Verbindung findet sich bei Kaukasiern und Asiaten, aber nicht bei Menschen afrikanischer Abstammung19.
Der Ausdrucksgrad von Erythrozyten CR1 korreliert auch mit dem Vorhandensein von Punktnukleotidmutationen in exon 13 Codierung SCR 10 (I643T) und in exon 19 Codierung SCR16 (Q981H). Es ist hoch in homozygoten 643I/981Q und niedrig in homozygoten 643T/981H Personen20. So drücken “niedrige” Individuen etwa 150 CR1/E aus, “mittlere” Individuen etwa 500 CR1/E und “hohe” Individuen etwa 1.000 CR1/E.
Zusätzlich zu diesem Erythrozytendichtepolymorphismus zeichnet sich CR1 durch einen Längenpolymorphismus aus, der vier Allotypen unterschiedlicher Größen entspricht: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) und CR1*4 (250 kDa)21 und ein antigener Polymorphismus, der der Blutgruppe KN22entspricht.
Wir stellen unsere Methode auf der Grundlage der Durchflusszytometrie vor, um die Dichte von CR1/E zu bestimmen. Mit einem niedrigen Dichtegrad (180 CR1/E), einer mittleren Dichte (646 CR1/E) und einer hohen Dichte (966 CR1/E) ist es einfach, die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ihrer Erythrozyten oder roten Blutkörperchen (RBC) oder RBC MFI nach Anti-CR1-Immunfärbung mit einem Durchflusszytometer zu messen. Man kann dann eine Standardlinie darstellen, die das MFI als Funktion der CR1/E-Dichte darstellt. Durch messung des MFI von Probanden, deren CR1/E-Dichte nicht bekannt ist, und vergleicht man es mit dieser Standardlinie, ist es möglich, die CR1/E-Dichte der Individuen zu bestimmen. Diese Technik wird seit vielen Jahren im Labor verwendet, und hat es uns ermöglicht, eine Verringerung der Expression von Erythrozyten CR1 in vielen Pathologien wie systemische Lupus erythematodes (SLE)23, Erworbene Immundefizienz-Syndrom (AIDS)24, Malaria25, und vor kurzem Alzheimer-Krankheit (AD)26,27. Die Entwicklung von Medikamenten, die auf CR1 abzielen, um sich mit Erythrozyten zu paaren, wie im Fall von Antithrombotika28 erfordert die Bewertung der CR1/E-Dichte und die Verfügbarkeit einer robusten Technik zur Quantifizierung von CR1.
Das vorgestellte Protokoll läuft in singlicate. Es ist anpassungsfähig, um die Dichte von CR1/E bei vielen Individuen mit spezifischen handelsüblichen 96 Brunnenplatten zu bestimmen (siehe Tabelle der Materialien). Zu diesem Zweck ist es einfach, unsere Methode an jede 96-Well-Platte anzupassen. Für jede Probe wird eine Zellsuspension von Erythrozyten (0,5 x 106–1 x 106 Erythrozyten) pro Brunnen verteilt. Für jeden Brunnen wird zunächst der primäre Anti-CR1-Antikörper hinzugefügt, dann Streptavidin PE, der sekundäre Anti-Streptavidin-Antikörper, und wieder Streptavidin PE, wobei die gleichen Verdünnungen wie die unserer Methode verwendet werden, aber durch Anpassung der Volumina und die Wahrung der Verhältnismäßigkeit.
Die Blutproben von Probanden des Bereichs und von Probanden, die für CR1 quantifiziert werden sollen, sollten gleichzeitig gezogen, bei 4 °C im Kühlschrank gelagert und bei 4 °C behandelt werden (auf Eis und/oder im Kühlschrank).
Protocol
Representative Results
Discussion
Zur Bestimmung der Dichte von Erythrozyten CR1 (CR1/E) stehen verschiedene Techniken zur Verfügung. Die ersten verwendeten Techniken waren die Agglutination roter Blutkörperchen durch Anti-CR1-Antikörper31 und die Bildung von Rosetten in Gegenwart von Erythrozyten, die mit C3b32beschichtet sind. Diese rudimentären Techniken wurden schnell durch Immunstaining-Methoden mit radioaktiv markierten Anti-CR1-Antikörpern1,33…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Mitgliedern der technischen Plattform URCACyt, Flow Cytometry, den Mitarbeitern der Abteilung für Immunologie und den Mitarbeitern der Abteilung für Innere Medizin und Geriatrie, die zur Optimierung und Validierung des Protokolls beigetragen haben. Diese Arbeit wurde von den Reims University Hospitals (Grant-Nummer AOL11UF9156) finanziert.
Materials
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman – type M25 – | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
Referanslar
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