Het meten van Erythroocyte Complement Receptor 1 met behulp van Flow Cytometrie
Özet
Het doel van deze methode is om de CR1-dichtheid in de erytrocyten van elk onderwerp te bepalen door te vergelijken met drie proefpersonen waarvan de erytrocyten CR1-dichtheid bekend is. De methode maakt gebruik van flow cytometrie na immunostaining van de erytrocyten van de proefpersonen door een anti-CR1 monoklonale antilichaam gekoppeld aan een versterkt systeem met behulp van fycoerythrin (PE).
Abstract
CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 voor C3b/C4b) is een hoog moleculair gewicht membraan glycoproteïne van ongeveer 200 kDa dat de activering van de activatie regelt, immuuncomplexen vervoert en deelneemt aan humorale en cellulaire immuunreacties. CR1 is aanwezig op het oppervlak van vele celtypes, waaronder erythrocyten, en vertoont polymorfismen in lengte, structuur (Knops, of KN, bloedgroep), en dichtheid. De gemiddelde dichtheid van CR1 per erythrocyte (CR1/E) is 500 moleculen per erythrocyt. Deze dichtheid varieert van individu tot individu (100-1.200 CR1/E) en van de ene erytrocyt tot de andere in hetzelfde individu. We presenteren hier een robuuste flow cytometrie methode om de dichtheid van CR1/E te meten, ook in onderwerpen die een lage dichtheid uitdrukken, met behulp van een versterkend immunostaining systeem. Deze methode heeft ons in staat gesteld om het verlagen van CR1 erytrocytenexpressie te tonen bij ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD), systemische lupus erythematosus (SLE), AIDS of malaria.
Introduction
CR1 (complement receptor type 1, CD35) is een 200 kDa transmembraan glycoproteïne aanwezig op het oppervlak van vele celtypes, zoals erythrocyten1, B lymfocyten2,monocytische cellen, sommige T-cellen, folliculaire dendritische cellen3,foetale astrocyten4, en glomeraire podocyten5. CR1 die zijn liganden C3b, C4b, C3bi6,,7,8,,9verstoort, een subeenheid van de eerste complementcomponent, C1q10 en MBL (mannan-bindende lectine)11 remt de activering van complement en is betrokken bij humorale en cellulaire immuunrespons.
Bij primaten, waaronder mensen, is erytrocyten CR1 betrokken bij het transport van immuuncomplexen naar de lever en milt, om het bloed te zuiveren en hun accumulatie te voorkomen in kwetsbare weefsels zoals de huid of nieren12,13,14. Dit fenomeen van immuunhechting tussen immuuncomplexen en erytrocyten hangt af van het aantal CR1-moleculen15. Bij mensen is de gemiddelde dichtheid van CR1/E slechts 500 (d.w.z. 500 moleculen CR1 per erytrocyt). Deze dichtheid varieert van individu tot individu (100-1.200 CR1/E) en van de ene erytrocyt tot de andere in hetzelfde individu. Sommige personen van “null” fenotype uitdrukken minder dan 20 CR1/E16.
De dichtheid van CR1/E wordt geregeld door twee co-dominante autosomaltale allelen gekoppeld aan een puntmutatie in intron 27 van de gencodering voor CR1*117,18. Deze mutatie produceert een extra beperkingsplaats voor het HindIII-enzym. De beperkingsfragmenten verkregen na de vertering met HindIII zijn in dit geval 7,4 kb voor het allel gekoppeld aan een sterke expressie van CR1 (H: hoog allel) en 6,9 kb voor het allel gekoppeld aan lage CR1-expressie (L: laag allel). Deze link is te vinden in Kaukasiërs en Aziaten, maar niet in mensen van Afrikaanse afkomst19.
Het expressieniveau van erytrocyten CR1 is ook gecorreleerd met de aanwezigheid van puntnucleotidemutaties in exon 13 codering SCR 10 (I643T) en in exon 19 codering SCR16 (Q981H). Het is hoog in homozygous 643I/981Q en laag in homozygous 643T/981H individuen20. Zo, “lage” individuen express ongeveer 150 CR1 /E, “medium” individuen express ongeveer 500 CR1 /E, en “hoge” individuen express ongeveer 1.000 CR1 / E.
Naast deze erytrocytendichtheid polymorfisme, cr1 wordt gekenmerkt door een lengte polymorfisme die overeenkomt met vier allotypes van verschillende grootte: CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), en CR1 * 4 (250 kDa)21 en een antigenpolymorfisme die overeenkomt met de bloedgroep KN22.
We presenteren onze methode op basis van flow cytometrie om de dichtheid van CR1/E te bepalen. Met behulp van drie proefpersonen waarvan de CR1/E-dichtheid bekend is, die een laag dichtheidsniveau (180 CR1/E), een gemiddelde dichtheid (646 CR1/E) en een hoge dichtheid (966 CR1/E) uitdrukken, is het gemakkelijk om de gemiddelde fluorescentieintensiteit (MFI) van hun erythrocyten of rode bloedcellen (RBC) of RBC MFI te meten, na anti-CR1 immunostaining met behulp van een stroomcytometer. Men kan dan een standaardlijn uitzetten die de MFI vertegenwoordigt als functie van CR1/E-dichtheid. Het meten van de MFI van proefpersonen waarvan de CR1/E-dichtheid niet bekend is en deze te vergelijken met deze standaardlijn, is het mogelijk om de CR1/E-dichtheid van de individuen te bepalen. Deze techniek is gebruikt voor vele jaren in het laboratorium, en heeft ons in staat gesteld om een vermindering van de expressie van erythrocyte CR1 detecteren in vele pathologieën zoals systemische lupus erythematosus (SLE)23, Verworven immunodeficiëntie syndroom (AIDS)24, malaria25, en onlangs de ziekte van Alzheimer (AD)26,27. De ontwikkeling van geneesmiddelen gericht op CR1 om te koppelen met erythrocyten, zoals in het geval van anti-trombotische geneesmiddelen28 vereist de evaluatie van CR1/E-dichtheid en de beschikbaarheid van een robuuste techniek om CR1 te kwantificeren.
Het gepresenteerde protocol loopt in singlicaat. Het is aanpasbaar om de dichtheid van CR1/E op veel individuen te bepalen met behulp van specifieke commercieel beschikbare 96 putplaten (zie Tabel van materialen). Hiertoe is het eenvoudig om onze methode aan te passen aan elke 96 putplaat. Voor elk monster wordt een celsuspensie van erytrocyten (0,5 x 106–1 x 106 erythrocyten) per put verdeeld. Voor elke put, eerst de primaire anti-CR1 antilichaam wordt toegevoegd, dan streptavidinPE, de secundaire anti-streptavidinantilichaam, en opnieuw streptavidinPE, met behulp van dezelfde verdunningen als die van onze methode, maar door aanpassing van volumes en evenredigheid respect.
De bloedmonsters van proefpersonen uit het verspreidingsgebied en van de voor CR1 te kwantificeren onderwerpen moeten tegelijkertijd worden genomen, bij 4 °C in de koelkast worden opgeslagen en bij 4 °C (op ijs en/of in de koelkast) worden behandeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende technieken beschikbaar om de dichtheid van erythrocyte CR1 (CR1/E) te bepalen. De eerste gebruikte technieken waren de agglutinatie van rode bloedcellen door anti-CR1 antilichamen31 en de vorming van rozetten in aanwezigheid van erytrocyten bekleed met C3b32. Deze rudimentaire technieken werden snel vervangen door immunobevlekmethoden met behulp van anti-CR1-antilichamen met behulp vanradiolabel1 1,3…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken alle leden van de URCACyt, flow cytometrie technisch platform, het personeel van de afdeling Immunologie, en het personeel van de afdeling Interne Geneeskunde en Geriatrie, die hebben bijgedragen aan het optimaliseren en valideren van het protocol. Dit werk werd gefinancierd door de universitaire ziekenhuizen van Reims (subsidienummer AOL11UF9156).
Materials
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman – type M25 – | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
Referanslar
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
- Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
- Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
- Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
- Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
- Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
- Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
- Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
- Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
- Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
- Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
- Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
- Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. İmmünoloji. 108 (4), 531-538 (2003).
- Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
- Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer’s disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
- Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer’s Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
- Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
- Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
- Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
- Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
- Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
- Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
- Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
- Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
- Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
- Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
- Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
- Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
- Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
- Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
- Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
- Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
- Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
- Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
- Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
- Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).
