具有更严格特异性的限制内核内核酶的体外定向进化

1. ESC的准备 克隆限制-改性系统的甲基转移酶，以低拷贝数质粒（例如，pACYC184 或 pACYC174 或其衍生物）进行设计。注：细菌宿主菌株必须能够耐受克隆酶引入的甲基化，并提供T7RNA聚合酶的诱导表达。建议使用 ER2566 菌株（携带 McrA、McrBC 和 Mrr 突变）。 确认重组质粒DNA通过干酪内联酶保护，在2小时2小时的缓冲和温度下用10单位的凝酶RE处理0.5μg的质粒DNA，防止裂解。 准备这种菌株的合格细胞。注：可以使用任何方法。NlaIV工程项目采用了简单的氯化钙法12。 在T7促进子体的控制下，用ORF构造重组质粒，其选择标记与步骤1.1中含有甲基曲酶基因的粒度标记不同。可以使用矢量 pET28 和 pET30。 通过引入静默突变，从T7促进剂和酶ORF停止的停止子体之间的重组质粒部分移除工程酶的所有识别位点（图2，表1A）。注：如果必须移除多个此类位点，则需要多个突变轮（步骤 1.5.1_1.5.7）。 使用内向的PCR反应，用底漆5端引入的设计变异来放大全长质粒（表2A）。 通过在PCR反应的50μL中加入10U DpnI内核酸，在37°C下孵育2小时，去除模板DNA。 通过琼脂胶电泳解决产品。切掉与全长质粒对应的带子，用商业套件纯化。 加入10倍结扎缓冲液（浓度为1倍），并补充ATP（至1 mM）。加入10U的T4多核苷酸激酶，并在37°C孵育20分钟。在70°C加热10分钟，使酶失去活性。 加入PEG 4000至5%，再次补充ATP（至1 mM），并加入5U的T4DNA连接。在室温 （RT） 下孵育 2 小时。 转化为携带同二苯甲醚甲基转移酶的合格细菌菌株（步骤1.1）。 小规模分离质粒DNA，确认通过多氧测序引入序列变化。 引入靠近寡核苷酸引导诱变所针对的序列的唯一限制位点（图2，表1B）。按照每个站点的步骤 1.5.1_1.5.7 操作。注：仅当使用目标突变时，才会执行此步骤。如果执行随机突变，跳过步骤 2-3，然后转到第 3 部分。在所述示例中，所有站点都引入到目标区域的上游，但它们也可以引入下游。 为 ESC 放大设计底漆（表 1C）。 设计一个反向引底结合下游的内核酶ORF，将引入选定的识别位点（R1）及其较短的版本（R2），这些识别位点（R2）在选定的NlaIV序列之外结合，并在5’末端包含生物素（参见图1）。 设计一个向前底漆 （F1） 绑定到 T7 启动器上游的 ESC。此引漆还应引入原始识别序列的反选择变体（即原始酶识别的序列变化的最大，所选反向序列除外）。注：稍后在选择性 PCR（步骤 5.9）中，将使用此底漆 （F2） 的较短版本（涵盖与反选择序列的远端序列）。 2. 诱生引物的分裂和混合合成 注：此步骤仅用于需要在多个站点上需要子饱和突变的项目。需要具有多个合成列的合成器。根据诱变频率分配用于合成随机NNS子体三胞胎和野生型三胞胎的列。例如，如果有 7 个相等的卷合成列，并且给定站点的突变率为 0.3 是可取的，则在 ±0.3 x 7 或两列中添加随机 NNS 协成，在 ±0.7 x 7 或 5 列中添加野生类型 codons（图 3）。 确定子饱和突变的站点。根据站点的假设重要性（即站点越重要，频率越高），选择突变频率，同时牢记整个库的复杂性限制（请参阅讨论）。 合成所有列中的寡核苷酸，在3’端的第二次次饱和突变位计数之前，达到三重。不要在最后一个合成周期移除 5′-trityl 保护组（使用合成器上的三元打开选项）。保护组将在下一个合成周期开始时删除（图 3中的步骤 1）。 打开合成列。将受控孔隙玻璃 （CPG） 合成支持收集到干燥的 1.5 mL 管中，并通过涡旋混合。将混合 CPG 树脂重新分区为新的合成柱。避免引入湿度，因为它会降低总体产量（图 3中的步骤 2 和 4）。 继续合成，从亚饱和突变位三合三开始。根据所需的诱变频率将列分配给随机的 NNS 三胞胎或野生类型三胞胎（见上文注释）。如果存在其他子饱和点，则仅继续在下一个子饱和突变位之前的三重位。同样，在合成器上保留一个 5′-trityl 组（合成器上的 5′-trityl 上选项）（图 3 中的步骤3）。然后继续步骤 2.3。 如果下游不再存在子饱和点，则完成合成，在合成器上留下一个 5′-trityl 组（合成器上为 5′-trityl 上选项）（图 3中的步骤 5）。 根据净化盒制造商的说明，对寡核苷酸库进行保护并净化。注：通过从CPG中解保护释放的寡核苷酸也可以在反向相高性能液相色谱（HPLC）中用三乙基进行纯化，然后进行手动三聚基去除（RT用80%醋酸进行1小时治疗）和第二次HPLC纯化。 检查尿素-PAGE凝胶中的寡核苷酸库质量。 3. 生成变体库 注：使用步骤 1.6 中的重组质粒。 通过寡核苷酸定向诱变生成库。注：或者，使用 EP-PCR 协议（步骤 3.2）。 将 T7 促进器的一个部分放大到具有诱变靶向的序列两侧的唯一限制性酶位点（在 NlaIV：SalI、EcoRI 或 Eco52I 的情况下）（表 1B-C、表 2B、图 4）。将第二部分从独特的限制性酶位点放大到ESC的3’末端。 将 PCR 反应的 5 μL（从步骤 3.1.1 起）与 8 μL 水、1.5 μL 的 10 倍限制酶缓冲液和 5 个相应限制性酶（SalI、EcoRI 或 Eco52I）单元分别混合，并在适当的温度下孵育 2 小时。 使用琼脂糖凝胶电泳解决两种反应的产品。切掉预期尺寸的带子，用商业套件进行净化。 在琼脂胶中运行多达 1/3 的纯化产品，并通过密度测定测量每个纯化带的浓度。 将ESCs的两个部分的结扎在1：1摩尔比与1x连接缓冲液和1UT4DNA连接和孵育2小时RT。 解决琼脂糖凝胶中的反应产物。切掉预期尺寸的产品，用商业套件进行净化。 使用引物 F1 和 R2（表 1C和表 2A）在 PCR 反应中放大纯化连接产品。不要运行超过 20 个放大周期。 分馏琼胶凝胶中的PCR反应。切掉产品，用商业套件进行净化。 从琼脂胶凝胶的前一步运行纯化库的5μL等位，并通过密度测量测量浓度。 克隆库的小样本（最多5μL）和序列>15克隆，以检查突变频率和分布（表3）。继续步骤 4。注：或者，可以使用 ESC 小样本的高吞吐量排序。 执行 EP-PCR。 使用引物 F1 和 R1 从步骤 1.5.7 中获得的质粒放大 ESC。使用 Taq I 聚合酶 （表 1B） 运行 20 个循环。 凝胶净化PCR产品。 使用上一步 2 纳的纯化 PCR 产品设置 EP-PCR，使用 F1 和 R1 引漆运行 15 个 EP-PCR 周期（表 1C）。 凝胶净化产品，并通过凝胶密度测定来量化。注：由于纯化EP-PCR产物浓度低，使用约1/3进行定量。 克隆库的小样本（最多1/5）和序列>15克隆，以检查突变频率和分布（表4）。注：或者，对 ESC 的小样本执行高通量排序。 4. 进行分段体转录-翻译反应 在体外转录翻译中测试内核酶表达和酶活性。 准备一个短（200~500 bp）基板，并带有一个识别位点，用于靠近分子中心的内核酸酶，以便容易地检测到裂解反应。注：制备基质的最简单方法是通过PCR放大任何DNA分子的适当片段。基板可以贴上放射性标签或荧光标记，以简化裂解检测。 根据制造商的建议，用0.5μg的野生ESC型的转录-转化反应设置50μL。将镁盐（MgCl2、MgSO4和醋酸镁可测试）添加到 1.5 mM 和上一步中适当数量的基质（如果 DNA 未标记时至少 0.5 μg）。注：可以使用任何不含镁激活的核酸核酸核酸的转录/翻译套件。一些试剂盒供应商在生产过程中使用核酸酶去除DNA污染，然后添加包质剂作为核酶抑制剂。此类套件与此方法不兼容。 根据制造商的说明孵化转录-翻译反应。然后将反应混合物转移到限制酶的最佳温度2小时。 分析琼脂凝胶基质的裂解，然后进行适当的检测（例如DNA染色、荧光可视化或自放射成像）（图5）。注：在进行分块化之前，至少需要部分裂解基板。如果无法实现，需要进一步优化镁的化学形式或其浓度。 通过在15 mL锥形管中加入225μL的跨度80和25μL的特威80至5mL矿物油，制备油表面活性剂混合物。通过轻轻反转管 15 倍彻底混合。 每个库将950 μL的油表面活性剂混合物转移到2 mL圆形底部低温小瓶，标签带有库名，并转移到冰上。将一个小圆柱形搅拌棒（5 x 2 mm2）放入每个小瓶中。 根据制造商的建议，制备体外转录-翻译反应混合物（每个库50μL）。用氯化镁补充混合物，最终浓度为1.5 mM（参见步骤4.1.4）。 将 50 μL 等分点分配到冰上 1.5 mL 管中。 在冰上的反应混合物中加入1.7个库（第3节）。注：不要使用较多的表达式库来选择效率。尽量减少含有多个DNA分子的水滴的频率至关重要。 为每个库连续准备油中水乳液。 将装满冰块的小烧杯（或大瓶杯）放在磁性搅拌器上，搅拌速度设置为 1，150 rpm。 将含有 950 μL 油表面活性剂混合物的低温小瓶和从步骤 4.3 到磁性搅拌器上的冷烧杯的小搅拌棒转移。检查搅拌杆是否旋转。 在30秒的间隔内加入体外库转录-翻译混合物的5个10μL等位，然后继续搅拌一分钟。将装有乳液的小瓶转移到冰容器。从步骤 4.7.2 开始，继续下一个库。 处理完所有库后，根据套件制造商的建议，开始孵化所有库。 将小瓶转移到工程内核酸的最佳温度上，再延长2小时，然后将其放入冰上至少10分钟。 5. 继续处理图书馆和选择 将低温小瓶中的乳液转移到冷1.5 mL管中，加入1 μL 0.5 M EDTA，并在室温下以13，000 x g离心5分钟。 使用移液器拆下上油相。如果油水相位不可见，在-20°C孵育管至少5分钟以冻结水相，然后立即移出液油相。 加入100 μL的10mM Tris HCl pH 8.0，立即进行150μL酚：氯仿（1：1 v/v）的萃取，通过短涡旋，然后相分离，以30s离心在13，000 x g。收集上水相。 加入醋酸钠（pH = 5.2）的0.1伏（15μL），2.5×5μg的糖原和2.5伏（375μL）乙醇，沉淀DNA。在-20°C下孵育1小时，在13，000 x g，4°C下15分钟。 g丢弃上清液，用 1 mL 冷 70% 乙醇短暂清洗颗粒。 在速度真空或空气干燥中干燥 DNA/糖原颗粒，进行 >5 分钟。 将颗粒溶解在 50 μL 的 10 mM Tris-HCl （pH = 7.5）。加入5 μL链球菌磁珠，根据制造商的说明制备，在RT时混合1小时，最好在转盘搅拌机或轻柔涡旋。 将磁架上的珠子分开，收集不含生物tin的DNA中丰富的液体。 通过乙醇沉淀浓缩DNA（步骤5.4~5.5）。 将上一步中的浓缩DNA溶解在5μL水中，并用作F2和R1底漆的PCR反应的模板（表1A）。注：为了避免模板污染问题，尽量减少PCR伪酶使用Taq聚合酶（不是Pfu或Phusion），并运行18-20个周期与模板大小成比例的扩展时间（1 kb = 1 分钟）（参见表2B）。 将 PCR 产品分馏为琼脂胶凝胶，并切出预期尺寸的产品。一些涂抹表明有不同尺寸的产品（参见图 6）。用商业套件从凝胶板中净化DNA。 使用步骤 5.10 和引引剂 F1 和 R2 的 DNA 进行第二次 PCR 反应，使用步骤 5.9 中相同的协议。按照 5.10 中所述的产品纯化操作。通过琼脂胶密度测定（不是紫外线光谱）定量后纯化DNA可用于下一轮体外选择（步骤4.6）。 6. 更改序列特异性的屏幕变体 克隆选定的变体。 从步骤 5.10 消化产品 2 小时与 10 U 的限制酶适合克隆到表达载体 （NlaIV： NcoI 和 XhoI） 在酶供应商推荐的温度和缓冲.用琼脂凝胶电泳解决产品，并分离预期尺寸片段。 使用与步骤 6.1.1 相同的酶通过双裂解制备质粒载体（例如 pET28），并通过商用 DNA 凝胶纯化试剂盒进行凝胶纯化。 用琼脂糖凝胶电泳测定出病媒的浓度和插入。 设置一个连接与1+5 U的T4DNA连接和载体：插入摩尔比1：3-1：5在1x加糖缓冲酶供应商推荐。在RT孵育2小时，并通过转化或电穿孔12引入适当的宿主细菌（从第1.3步起）。 在含有适当抗生素（pET28 或 pET30 载体的 50 μg/mL 卡那霉素）和 1% 葡萄糖的 LB 板上选择转化剂。 快速蛋白质变异。 从转化的单菌落点（在一次运行中可以很容易地处理24个克隆）成2 mL的LB与卡那霉素（50μg/mL）和1%葡萄糖，并在37°C摇抖下生长过夜。 接种15 mL的温暖（37°C）LB含有100μg卡那霉素，无葡萄糖与0.75 mL的过夜培养，并在37°C孵育剧烈的震动。注：可以使用 50 mL 离心机管或 100 mL Erlenmayer 烧瓶。 将176μL的甘油加入1 mL的过夜培养（甘油的最终浓度 = 15%）彻底混合，在-70°C下冷冻。 在 2⁄3 h 后，使用 IPTG 补充 15 mL 的培养（从步骤 6.2.1）到 1 mM 和培养，额外 5 小时。 通过离心（10，000 x g，4°C，10 分钟）收集细菌颗粒，并在 -70 °C 下冷冻。 净化蛋白质变异。 将 20 μL 镍亲和树脂悬浮液转移到 200 μL B1 缓冲液管中，在具有宽孔移液器尖端的 1.5 mLg管中，轻轻混合，并离心机（5，000 x g，30 s，4 °C）。通过移液去除上清液，并将管子留在冰上。 通过剧烈涡旋将细菌颗粒从B1300μL的步进6.2.5中重新悬浮。将悬架转移到 1.5 mL 管中。 在B1中加入3μL的100x蛋白酶抑制剂鸡尾酒和淋索素溶液（最终浓度为1mg/mL）。通过用配备尖端的探头声波分解细胞。每个样品使用六个 10 s 突发，中间的冰中有 >15 s 尖端冷却时间。始终保持细胞悬浮在冰上。 通过离心（2 分钟、12，000 x g、4°C）将 250 μL 的上清液从步骤 6.3.1 转移到树脂等位物的颗粒细胞碎片。 在寒冷的房间里混合15分钟，最好在旋转木马搅拌机中或通过温和的涡旋。 离心机（5，000 gx g，30 s，4 °C），用移液器吸气上清器。 加入 500 μL 的 W 缓冲液，轻轻重新悬浮树脂。离心机（5，000 gx g，30 s，4 °C），用移液器吸气上清器。 重复步骤 6.3.7。 加入20 μL的缓冲液E，轻轻重新悬浮树脂，将样品留在冰上2~5分钟。离心（5，000 x gg，30 s，4°C），然后收集上清液。 重复步骤 6.3.9。池超子。 通过 SDS-PAGE （5~10 μL） 分析蛋白质样本（图 7）。 筛选具有更改特异性的变体。 在噬菌体lambdaDNA上检测裂解活性。蛋白质样本可构成最终反应量的10%。每0.5μgDNA中总共2μL的蛋白质样本和2小时反应时间是一个很好的起点。 分析由阿加丝凝胶电泳反应产物以及野生型酶产生的产品。选择产生裂解模式的克隆人与野生类型酶产生的模式明显不同，以便进一步分析（图8）。