Özet

Visualisation et analyse des artères pharyngées à l’aide de l’immunohistochimie à monture entière et de la reconstruction 3D

Published: March 31, 2020
doi:

Özet

Ici, nous décrivons un protocole pour visualiser et analyser les artères pharyngées d’arc 3, 4, et 6 des embryons de souris utilisant l’immunofluorescence entière de montage, le dégagement de tissu, la microscopie confocale, et la reconstruction 3D.

Abstract

La formation ou le remodelage inadéquats des artères d’arc pharyngée (PAAs) 3, 4 et 6 contribuent à certaines des formes les plus graves de maladie cardiaque congénitale. Pour étudier la formation des APA, nous avons mis au point un protocole utilisant l’immunofluorescence à monture entière couplée à l’élimination des tissus de l’alcool et du benzyl benzylo (BABB) et à la microscopie confocale. Cela permet la visualisation de l’endothélium d’arc pharyngé à une résolution cellulaire fine ainsi que la connectivité 3D de la vascularisation. À l’aide d’un logiciel, nous avons établi un protocole pour quantifier le nombre de cellules endothéliales (CE) dans les APE, ainsi que le nombre d’EC dans le plexus vasculaire entourant les APA dans les arcs pharyngés 3, 4 et 6. Lorsqu’elle est appliquée à l’ensemble de l’embryon, cette méthodologie fournit une visualisation complète et une analyse quantitative de la vascularisation embryonnaire.

Introduction

Pendant l’embryogenèse de souris, les artères d’arc pharyngées (PAA) apparaissent comme des paires symétriques et bi-latérales d’artères qui relient le coeur avec l’aortae dorsale1. Au fur et à mesure que l’embryon se développe, les premières et deuxièmes paires de PAAs régressent, tandis que les 3rd,4eet 6e PAAs subissent une série d’événements asymétriques de remodelage pour former les artères aortiques de l’arc2.

Les PAA 3, 4 et 6 se développent via la vasculogenèse, qui est la formation de novo des vaisseaux sanguins3. Les défauts dans la formation ou le remodelage de ces artères d’arc donnent lieu à diverses malformations cardiaques congénitales, telles que celles vues dans les patients présentant le syndrome de DiGeorge4,5. Par conséquent, la compréhension des mécanismes qui réglementent le développement des APA peut mener à une meilleure compréhension de l’étiologie congénitale des maladies cardiaques (CHD).

Les approches actuelles pour visualiser et analyser le développement de l’AAP comprennent l’immunofluorescence des sections tissulaires, les moulages vasculaires, l’injection d’encre en Inde, la microscopie épiscopique à haute résolution, et/ou l’immunohistochimie à monture entière1,4,5,6,7. Ici, nous décrivons un protocole combinant l’immunofluorescence de monté entière, la microscopie confocale et le rendu d’image 3D afin de recueillir, d’analyser et de quantifier des données volumétriques, la connectivité vasculaire et l’identité cellulaire. En outre, nous détaillons une méthode pour compartimenter et quantifier le nombre de CE dans chaque arc pharyngeal comme un moyen d’étudier la formation du plexus vasculaire d’arc pharyngé et son remodelage dans les PAA. Bien que ce protocole soit conçu pour analyser le développement de l’AAP, il peut être utilisé pour analyser d’autres réseaux vasculaires en développement.

Protocol

L’utilisation et les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Rutgers. 1. Préparation de solutions Préparer 1 L de phosphate tamponné saline avec 0,1% Triton-X-100 (PBST) et filtrer stériliser. Cette solution peut être stockée à température ambiante (RT) pendant au moins un an. Préparer 600 L de tampon de blocage composé de 10% de sérum d’âne normal dans P…

Representative Results

Le protocole d’immunofluorescence à monture entière présenté ici produit des résultats clairs et propres, permettant la reconstruction 3D de l’endothélium pharyngé, comme on le voit dans la figure 1A. Il est important d’incuber des embryons pendant suffisamment de temps dans chaque solution d’anticorps pour assurer une pénétration complète à travers l’échantillon, ainsi que, le lavage complet des embryons après l’incu…

Discussion

La capacité de visualiser l’endothélium dans les embryons de souris en 3D a fourni de nouvelles perspectives dans leur développement3. Nous présentons ici un protocole qui permet l’imagerie 3D haute résolution des embryons, la visualisation de la connectivité vasculaire et les analyses quantitatives de la formation de PAA. Ce protocole peut être utilisé pour voir comment les altérations génétiques ou les insultes environnementales influent sur le développement de l’AAP. La procé…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Brianna Alexander, Caolan O’Donnell et Michael Warkala pour la lecture et l’édition minutieuses de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le financement de l’Institut national du cœur, du poumon et du sang des NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 à SA; L’AJR est appuyée par l’AJR HL103920-08S1 et la subvention de l’Institut national de formation de l’arthrite et des maladies musculo-squelettiques et des maladies de la peau T32052283-11.

Materials

10x PBS MP Biomedicals PBS10X02
20x water immersion objective Nikon MRD77200
Agarose Bio-Rad Laboratories 1613101
Alexa Fluor 488 anti-goat Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 555 anti-mouse Invitrogen A-31570
Analysis Software Imaris 9.2.0
Benzyl Alcohol Sigma-Aldrich 305197
Benzyl Benzoate Sigma-Aldrich 8.18701.0100
Cover Slips VWR 16004-312
DAPI (5 mg/mL stock) Fisher Scientific D3571
Eppendorf Tubes (2.0 mL) Fisher Scientific 05-408-138
Ethanol VWR 89370-084
Falcon tubes (50 mL) Corning 352098
Fast wells Grace Bio Labs 664113
Forceps Roboz RS-5015
Goat anti-VEGFR2 R&D Systems, Inc. AF644
Methanol VWR BDH1135-4LP
Microscope Nikon A1HD25
Mouse anti-ERG Abcam ab214341
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Petri dishes (35 mm) Genesee Scientific 32-103
Petri dishes (60 mm) Genesee Scientific 32-105
Plastic Molds VWR 18000-128
Scapels Exelint International Co. 29552
Triton-X-100 Fisher Scientific BP 151-500

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Ramirez, A., Astrof, S. Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (157), e60797, doi:10.3791/60797 (2020).

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