このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。
タンパク質の複数の翻訳後修飾(PTM)を研究することは、PTMクロストークを理解し、タンパク質機能に関するより全体的な洞察を得るための重要なステップです。マルチPTM濃縮研究の重要性にもかかわらず、PTMの複数のグローバルプロテオーム分析を行うために必要な費用、時間、および大量のタンパク質量のために、一度に複数のPTMを調査する研究はほとんどありません。このプロトコルで詳述されている「ワンポット」アフィニティエンリッチメントは、低量のサンプルを含むリジン残基を含むペプチドの同時同定と定量を可能にすることによって、これらの障壁を克服する入力。このプロトコルには、SIRT5ノックアウトマウスのマウス肝臓からのタンパク質ライセートの調製、トリプシン消化の性能、PTMの濃縮、およびデータ独立型獲得(DIA)ワークフローを用いた質量分析分析のパフォーマンスが含まれる。このワークフローは、同じサンプルから2つのPTMを同時に濃縮できるため、大量のサンプルを必要とせずにPTMクロストークを研究するための実用的なツールを提供し、サンプル調製、データの調製に必要な時間を大幅に短縮します。取得、および分析を行います。ワークフローの DIA コンポーネントは、包括的な PTM 固有の情報を提供します。DIA は、さまざまな PTM ローカライズ アイソフォームを区別するために計算で解読できるフラグメントイオンの包括的なセットを提供するため、PTM サイトのローカリゼーションを研究する際に特に重要です。
翻訳後の無数の修飾は、活性1、シグナル伝達2、およびターンオーバー3、4に対する作用を通してタンパク質および経路を動的に調節する。例えば、リン酸基5の添加によりタンパク質キナーゼが活性化または不活性化され、ヒストンアセチル化および他の修飾は、クロマチン構造を変化させ、転写調節機構6,7として機能するメカニズムを提供する。近年、複数のPTMが協調して働くか、タンパク質機能または活性を調節するために競合しているという証拠が高まっています8,9,10,11.そのため、PTM クロストークを理解することは、PTM 研究における新たなニーズです。しかし、PTMサイトを識別し定量するほとんどのプロテオームワークフローは、複数の改変の相互作用ではなく、単一の改変に焦点を当てています。記載されたワークフローは、複数の異なるPTMによって修飾される特異的タンパク質修飾「ホットスポット」およびリジン残基を相関させる。
科学界では、複数のPTMを同時に12個の研究に向けた、実現可能な方法が求められる。PTMの複数のタイプのサイトをグローバルに識別し、定量化するほとんどの方法は、高いコストと組織の量が12、13を必要とするため、困難です。マルチPTM濃縮実験は、サンプル調製、データ収集、およびデータ分析の面で時間がかかるだけでなく、通常、これらの研究は、タンパク質11の大量かつしばしば禁止量を必要とします。ここで説明する複数の PTM の同時エンリッチメントと分析のためのプロトコルは、これらの障壁のいくつかに対処し、さまざまな PTM14間の大規模な PTM プロファイリングとクロストークの評価を可能にします。このワンポットワークフローは、生物医学研究者が複数のPTMをグローバルにプロファイリングし、共変性ペプチドを同定し、PTMクロストークを効率的かつ費用対効果の高い方法で研究するための実用的な方法を概説します14,15.
ここでは、50年以上前に最初に研究されたミトコンドリアタンパク質アシル化を調べることによって紹介されています。具体的には、リジンアセチル化17とコハシニル化18に、タンパク質に対するこれらの修飾の共発生、さらにはペプチドレベルでの共修飾を含む。研究はサーチュイン5(SIRT5)ノックアウトマウスモデルを使用しているので、アセチル化および凝集部位の濃縮に焦点を当てることが選ばれました。この決定は、コハクニル化部位がSIRT5 desuccinylaseの標的であり、KOマウスで有意な上方調節を示すことを期待されているためであり、この場合において最も関連性の高いPTMとなる。両方のPTMは、最近Carricoら19によって要約されているように生物学的に関連しています。一般に、アセチル化は遺伝子発現および代謝に重要な影響を及ぼし、そして、コハクニル化は心臓代謝および機能20を調節することが報告されている。
上記のプロトコルは、タンパク質の投入物質の量が少ない(例えば、1mgのタンパク質ライセート)で行われ、サンプル処理、MS取得、およびデータ分析に費やされる時間を短縮することにより、実験の総持続時間を短縮することができる。ワークフローの回路図は、図 1に示されています。また、さらに低い量の出発物質(タンパク質ライセートの100μgまで、それに応じて使用されるビーズの量を縮小)を使用しており、予想通り、同定されたアシル化ペプチドの全体的な収率を低下させます。しかし、それはまだ非常に貴重な結果と定量化されたペプチドを提供します。
いわゆるトップダウンまたはミドルダウンのワークフローでは、通常、タンパク質分解酵素アプローチを使用しません(したがって、1つのタンパク質内の複数のPTMの接続性を維持します)、このプロトコルは、PTMの同定と定量のための余分な深さと感度を得るためのペプチドベースの親和性エンリッチメントアプローチに焦点を当てています(図1)。さらに、このペプチド中心のワークフローは、1)スペクトルライブラリを生成するためのデータ依存型取得(DDA)の組み合わせ、およびラベルフリーワークフローにおける正確なPTM定量のための2)データ非依存の取得(DIA)を含む最新の質量分析法を利用する。
DIAワークフローは、サンプリングされたm/z範囲21内のすべてのペプチド信号を包括的に断片化することにより、典型的なDDAスキャンスキームのサンプリングストカスティシティを克服する。この特徴は、ペプチド内でどの特定の断片イオンが修飾されているかに関する情報を得やすくなるため、部位局在化の点でも非常に有益である。さらに、DIAワークフローは、同一の前駆体イオンを有するマイナーPTMペプチドアイソフォームの同定および定量化を可能にする。DIA法はまた、常に包括的に測定される特定の対応する断片イオンに基づいて、ペプチド内の特定のPTM部位の局在を決定することができる。しかし、DDAアプローチでは、同じ前駆体イオンに対してMS/MSの複数のサンプリングを除外する「動的除外」機能を利用することが多く、マイナーPTMアイソフォームが欠落しています。
ここで説明する同時エンリッチメント戦略は、複数のPTMのグローバルプロファイリングと定量化、PTMクロストークの検証、翻訳後の変更の動的相互作用の理解の恩恵を受ける研究に最適です。1つの結合されたワークフローにおける複数の濃縮PTMの同定は、タンパク質分解ペプチドを含むPTMのグローバル、シリアルまたは並列の濃縮、またはインタクトタンパク質の分析によって説明されています。アセチル化およびコハクチル化の連続濃縮と直接比較して、ワンポット方法論の効率は非常に類似した14として確立された。これらの代替プロトコルは、出発材料と時間のかなりの量を必要とし、非常に高価なことができます。これに対し、ワンポットプロトコルは、その後の分析と同定を伴う複数のPTMの濃縮のための安価で効率的な方法を提供します。
マウス肝組織はSIRT5ノックアウトマウスから得られ、ここで出発物質として使用される。このプロトコルは、異なる組織または細胞培養実験からのタンパク質のライセートに対しても行うことができる。このプロトコルは、組織または細胞培養ペレットから得られるタンパク質ライセートに適用することができる。
このプロトコルは、PTM クロストークをより効果的に理解するために、複数の PTM エンリッチメントを同時に行うための新しい手法を記述します。この目的に到達する代替方法は、非常に時間がかかり、高価である傾向があり、11、13を成功させるために大量のタンパク質を必要とします。このプロトコルは、実験の全体的な効率を向上させるために、2つのPTMの抗体結合ビーズに一度にインキュベーションを含むマルチPTM濃縮ワークフローを提示します。この方法はまた、分光ライブラリー生成およびDIA MS取得のためのDDAの使用を含み、フラグメントイオン22、23からの干渉を低減して存在するペプチドを検出および定量する。MSデータベース検索エンジンなどのソフトウェアプログラムは、DDA取得のデータを分析および定量するために使用されますが、定量プロテオミクスソフトウェア24および特定のDIA定量分析ソフトウェア25は、DIA取得によって生成された複雑なスペクトルを解釈するために必要です。
このプロトコルには、注意深く従うべき重要な手順がいくつかあります。プロトコルの主な目的は、複数のPTMを同時に濃縮することであるため、抗体アフィニティエンリッチメントステップ(セクション2)は実験の成功に不可欠です。ビーズに対してワッシュを行う場合、ビーズのどれも誤って吸引されないようにする必要があります。トリプシンで消化する前に尿素濃度を1Mに希釈したことを確認することも必要である(ステップ1.8)。タンパク質可溶化のプロトコルでは8M尿素が早く必要ですが、1Mを超える尿素濃度はトリプシンの酵素活性を阻害します。さらに、プロトコル全体でサンプルのpHを一貫してチェックすることが重要です。これは消化前に特に重要です。サンプルとトリプシン溶液のpHがインキュベーション前に適切に中和されない場合、多くの切断部位が見逃される非効率的な消化をもたらし、ペプチド同定が少なくなる可能性がある。
サンプルを準備する際には、プロトコルに対するいくつかの変更が役立つ場合があります。出発物質の1mgから調達したタンパク質ライセートの場合、各PTMスキャンチューブに設けられた抗体ビーズの4分の1を、費用対効果の高い代替物として使用することができる。より多量の出発物質は、使用される抗体ビーズの量が比例して増加する限り、より良い結果を得ることができます。ワークフローを強化できるもう 1 つの修飾は、トリプシンに加えて別のプロテアーゼでサンプルを消化することです。この修飾は、切断されたペプチドのより多くの変動をもたらし、タンパク質残基のカバレッジを増加させる。必要ではないが、トリプシンは、その高い切断特異性26によるPTM分析に用いられる酵素の1つであることが推奨される。
このプロトコルの制限は、研究されているPTMが14を同時に濃縮するために同様の化学を持つ必要があることです。異なる抗体結合ビーズの手順は、類似の溶媒および溶液を利用して、同様の溶出条件を含む類似の溶媒を利用し、好ましくは同じベンダーからである必要があります。このため、ここで概説する方法は、一例としてアセチル化およびコハシニル化を一貫して使用し、どちらも抗体共役ビーズ(Cellシグナル伝達技術社)を使用する。この方法は理論的には任意の数のPTMに適用できますが、この点でプロトコルの正確な制限を評価するために追加の研究が必要です。さらに、これは抗体ベースの濃縮方法であるため、この方法はPTM部位の相対的な定量しか提供できない。
既存のマルチPTMエンリッチメント方式と比較して、このワークフローは、より実現可能でコスト効率の高い代替手段です。この実験から、この方法の有効性は、個人またはシリアル濃縮などの代替方法と非常によく比較することが観察された。図2Bは、単一PTM濃縮およびシリアルPTM濃縮13と比較して、ワンポット法において、修飾ペプチドピーク領域の中央値CVが実際に減少したことを示す。さらに、アセチル化またはコハクニル化のためのサイトレベルの定量を評価する実験結果を分析した。さらに、スピアマン相関分析(図2C,D)は、ワンポットPTMエンリッチメントがシングルPTMエンリッチメントワークフローと同様に実行されることを実証しました。これはペプチドとフラグメントレベルの相関についても当てはまる。1ポットとシリアルPTM濃縮を比較する際に、3つの相関すべてに対して同じ観測が行われました。
このプロトコルにより、研究者はPTMクロストークに関する魅力的な生物学的洞察を迅速かつ費用対効果の高い方法で行うことができます。ワークフローのDIAコンポーネントは、サイトローカリゼーションに関する情報を提供し、PTMの低サイト占有率などの課題を克服するため、PTMに関する理解を深めることができます。この方法を使用して同時にエンリッチできる PTM の上限を評価するために、フォローアップ実験を行うことができます。このワークフローの将来の改善には、サイトのローカリゼーションとPTMサイト占有の分析をさらに自動化するための、より高度なソフトウェアプラットフォームの開発が含まれる可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
我々は、バック研究所(1S10 OD016281)におけるTripleTOFシステムに対するNIH共有計装交付金からの支援を認める。この研究は、国立アレルギー・感染症研究所(R01 AI108255からB.S.)と国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(R24 DK085610からエリック・ヴェルディン)によってもサポートされました。R01 DK090242 から エリック・ゲッツマンへ)。X.X.は、国立衛生研究所(NIH助成金T32GM8806、ジュディス・カンピシとリサ・エラービーへの助成金)によって支援され、N.B.はグレン医学研究財団の博士研究員によって支援されました。
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |