Questo flusso di lavoro descrive contemporaneamente le prestazioni dell’arricchimento in termini di tempo ed efficiente in termini di costi di più modifiche post-traslazionali proteiche (PPM) per l’analisi proteomica globale quantitativa. Il protocollo utilizza l’arricchimento PTM a livello di peptide con più anticorpi coniugati, seguito dall’analisi della spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati per ottenere informazioni biologiche sul crosstalk PTM.
Lo studio di più modifiche post-traduzionali (PTM) di proteine è un passo cruciale per comprendere il crosstalk PTM e ottenere informazioni più olistiche sulla funzione proteica. Nonostante l’importanza degli studi di arricchimento multi-PTM, pochi studi studiano più di un PTM alla volta, in parte a causa delle spese, del tempo e delle grandi quantità proteiche necessarie per eseguire più analisi proteomiche globali dei PTM. L’arricchimento dell’affinità “one-pot” dettagliato in questo protocollo supera queste barriere consentendo l’identificazione simultanea e la quantificazione di peptidi con residui di lisina contenenti PTM di acetilazione e succinylation con basse quantità di campione Input. Il protocollo prevede la preparazione di lesitra proteici da fegati di topo di topi knockout SIRT5, prestazioni di digestione della cipina, arricchimento per PTM e prestazioni di analisi spettrometrica di massa utilizzando un flusso di lavoro di acquisizione indipendente dai dati (DIA). Poiché questo flusso di lavoro consente l’arricchimento simultaneo di due PtM dallo stesso campione, fornisce uno strumento pratico per studiare il crosstalk PTM senza richiedere grandi quantità di campioni e riduce notevolmente il tempo necessario per la preparazione dei campioni, i dati l’acquisizione e l’analisi. Il componente DIA del flusso di lavoro fornisce informazioni complete specifiche su PTM. Ciò è particolarmente importante quando si studia la localizzazione del sito PTM, poiché DIA fornisce set completi di ioni di frammento che possono essere decifrati computazionalmente per distinguere tra diverse isoforme di localizzazione PTM.
Una miriade di modifiche post-traduzionali regolano dinamicamente le proteine e i percorsi attraverso gli effetti sull’attività1, segnalando2e fatturato3,4. Ad esempio, le chinasi proteiche vengono attivate o disattivate dall’aggiunta di gruppi di fosfati5, e l’acetilazione degli istoni e altre modifiche forniscono un meccanismo per modificare la struttura della cromatina e fungono da meccanismi regolatori trascrizionali6,7. Negli ultimi anni, la prova ha montato che più PTM lavorano in concerto o competono per regolare la funzione o l’attività delle proteine8,9,10,11. Pertanto, comprendere il gambo incrociato PTM è un’esigenza emergente nella ricerca PTM. Tuttavia, la maggior parte dei flussi di lavoro proteomici disponibili per identificare e quantificare i siti PTM si concentra su singole modifiche, piuttosto che sull’interazione di più modifiche. Il flusso di lavoro descritto correla la modifica di proteine specifiche “hot-spot” e residui di lisina che vengono modificati da più PTM diversi.
La comunità scientifica ha sempre più bisogno di metodi fattibili per studiare più PPM contemporaneamente12. La maggior parte dei metodi per identificare e quantificare globalmente i siti di più tipi di PTM sono impegnativi a causa degli elevati costi e della quantità di tessuto richiesti12,13. Non solo gli esperimenti di arricchimento multi-PTM richiedono molto tempo in termini di preparazione del campione, acquisizione dei dati e analisi dei dati, ma questi studi in genere richiedono grandi quantità e spesso proibitive di proteine11. Di seguito è descritto un protocollo per l’arricchimento e l’analisi simultanei di più PTM, che affronta anche diverse di queste barriere e consente la profilazione PTM su larga scala e la valutazione del crosstalk tra i vari PTM14. Questo flusso di lavoro one-pot delinea un modo pratico per i ricercatori biomedici di profilare globalmente più PTM, identificare peptidi co-modificati e studiare il crosstalk PTM in modo efficiente ed economico14,15.
Qui, questo metodo è mostrato esaminando l’acilazione delle proteine mitocondriali, che è stata studiata per la prima volta oltre 50 anni fa16. Si concentra specificamente sull’acetilazione lisina17 e sulla succinylation18, compresa la co-occorrenza di queste modifiche sulle proteine e persino la co-modifica a livello di peptide. Poiché lo studio utilizza un modello di topo knockout sirtuin 5 (SIRT5), è stato scelto per concentrarsi sull’arricchimento dei siti di acetilazione e succinylation. Questa decisione è stata presa perché i siti di succinylation sono obiettivi di SIRT5 desuccinylasi e si prevede quindi di mostrare una significativa upregulation nei topi KO, rendendoli i PTM più rilevanti in questo caso. Entrambi i PTM sono biologicamente rilevanti come recentemente riassunto da Carrico etal. In generale, l’acetilazione mostra importanti effetti sull’espressione genica e sul metabolismo, e il succinylation è stato segnalato per regolare il metabolismo cardiaco e la funzione20.
Il protocollo descritto può essere eseguito con una bassa quantità di materiale di input proteico (ad esempio, 1 mg di lisato proteico) e riduce la durata totale dell’esperimento riducendo il tempo impiegato per l’elaborazione del campione, l’acquisizione di MS e l’analisi dei dati. Nella Figura 1viene fornito uno schema del flusso di lavoro . Abbiamo anche usato quantità ancora più basse di materiale di partenza (fino a 100 g di lisato proteico, riducendo le quantità di perline utilizzate di conseguenza), che, come previsto, riduce la resa complessiva dei peptidi acilati identificati; tuttavia, fornisce ancora risultati di grande valore e peptidi acilati quantificabili.
Mentre i cosiddetti flussi di lavoro dall’alto verso il basso o medio-verso il basso in genere non utilizzano approcci di digestione proteolitica (e quindi mantenere la connettività di più PTM all’interno di una proteina), questo protocollo si concentra su un approccio di arricchimento dell’affinità basato su peptidi per ottenere maggiore profondità e sensibilità per l’identificazione e la sensibilità del PTM (Figura 1). Inoltre, questo flusso di lavoro incentrato sui peptidi utilizza moderni metodi di spettrometria di massa, tra cui 1) una combinazione di acquisizione dipendente dai dati (DDA) per generare librerie spettrali e 2) acquisizioni indipendenti dai dati (DIA) per una quantificazione PTM accurata in un flusso di lavoro privo di etichette.
I flussi di lavoro DIA superano la stocasicità di campionamento dei tipici schemi di scansione DDA frammentando in modo completo tutti i segnali peptidici all’interno dell’intervallo m/z campionato21. Questa caratteristica è anche estremamente utile in termini di localizzazione del sito, perché è più facile ottenere informazioni riguardanti quali ioni di frammento specifici sono modificati all’interno del peptide. Inoltre, i flussi di lavoro DIA consentono l’identificazione e la quantificazione di isoformi PTM-peptidi minori con ioni precursori identici. I metodi DIA possono anche determinare una localizzazione specifica del sito PTM all’interno di un peptide sulla base di specifici ioni di frammento corrispondenti che vengono misurati in modo completo in ogni momento. Tuttavia, gli approcci DDA spesso utilizzano funzionalità di “esclusione dinamica” che escludono più campionamenti di MS/MS per lo stesso ione precursore, mancando quindi le isoforme PTM minori.
La strategia di arricchimento simultaneo qui descritta è ideale per studi che beneficeranno della profilazione e della quantificazione globali di più PTM, esaminando il crosstalk PTM e comprendendo le interazioni dinamiche delle modifiche post-traduzionali. L’identificazione di più PTM arricchiti in un unico flusso di lavoro combinato è stata descritta da: arricchimento globale, seriale o parallelo di PTM contenente peptidi proteolitici, o in alternativa dall’analisi di proteine intatte. Nel confronto diretto con l’arricchimento seriale dell’acetilazione e della succinylazione, l’efficienza della metodologia monocanta è stata stabilita come molto simile14. Questi protocolli alternativi richiedono quantità significative di materiale e tempo di partenza e possono essere proibitivi. Al contrario, il protocollo one-pot fornisce un metodo economico ed efficiente per l’arricchimento di più di un PTM con analisi e identificazione successive.
Tessuti epatici del topo sono ottenuti da topi KNOCKout SIRT5 e sono utilizzati qui come materiale di partenza. Questo protocollo può essere eseguito anche per le talità proteiche da diversi tessuti o esperimenti di coltura cellulare. Questo protocollo può essere applicato a lismi proteici ottenuti da tessuti o pellet di coltura cellulare.
Questo protocollo descrive una nuova tecnica per l’arricchimento simultaneo di più PTM per comprendere in modo più efficace il crosstalk PTM. I metodi alternativi per raggiungere questo obiettivo tendono ad essere proibitivi in termini di tempo e costosi, e richiedono grandi quantità di proteine per avere successo11,13. Questo protocollo presenta un flusso di lavoro di arricchimento multi-PTM che prevede l’incubazione in perline coniugate agli anticorpi per due PPM contemporaneamente per migliorare l’efficienza complessiva dell’esperimento. Questo metodo prevede anche l’uso di DDA per la generazione di librerie spettrali e acquisizioni DIA MS per rilevare e quantificare i peptidi presenti con le interferenze ridotte da ioni di frammento22,23. I programmi software, come i motori di ricerca di database MS, vengono utilizzati per analizzare e quantificare i dati delle acquisizioni DDA, mentre Quantitative Proteomics Software24 e specifico DIA Quantitative Analysis Software25 sono necessari per interpretare i complessi spettri prodotti dalle acquisizioni DIA.
Ci sono diversi passaggi critici all’interno di questo protocollo che devono essere seguiti con attenzione. Poiché l’obiettivo principale del protocollo è quello di arricchire simultaneamente per più PTM, la fase di arricchimento dell’affinità anticorpale (sezione 2) è fondamentale per il successo dell’esperimento. Quando si eseguono fusa sulle perline, è necessario assicurarsi che nessuna delle perline sia aspirata accidentalmente. È necessario anche garantire che la concentrazione di urea sia stata diluita a 1 M prima della digestione con la trypsin (passaggio 1.8). Anche se 8 M di urea è richiesto all’inizio del protocollo per la solubilità delle proteine, le concentrazioni di urea superiori a 1 M inibiranno l’attività enzimatica di trypsin. Inoltre, è importante controllare costantemente il pH del campione durante tutto il protocollo. Questo è particolarmente importante prima della digestione. Se il pH del campione e la soluzione di trypsin non vengono neutralizzati in modo appropriato prima dell’incubazione, può provocare una digestione inefficiente in cui molti siti di scissione possono essere persi, con conseguente minor identificazione dei peptidi.
Alcune modifiche al protocollo possono essere utili durante la preparazione dei campioni. Per una proteina lisato procurato da 1 mg di materiale di partenza, un quarto delle perle anticorpali fornite in ogni tubo di scansione PTM può essere utilizzato come alternativa conveniente. Una maggiore quantità di materiale di partenza può essere utilizzato per risultati migliori, purché la quantità di perline anticorpali utilizzate siano aumentate proporzionalmente. Un’altra modifica che può migliorare il flusso di lavoro consiste nel digerire i campioni con un’altra proteasi oltre alla trypsin. Questa modifica comporterebbe una maggiore variabilità nei peptidi scissi, fornendo una maggiore copertura dei residui proteici. Anche se non è necessario, si raccomanda che la trypsin sia uno degli enzimi utilizzati per l’analisi PTM a causa della sua elevata specificità di scissione26.
Una limitazione di questo protocollo è che le PTM studiate devono avere prodotti chimici simili per essere arricchiti contemporaneamente14. Le procedure per le diverse perle coniugate anticorpi devono essere simili, utilizzando solventi e soluzioni simili, comprese condizioni di eluizione simili, e preferibilmente dallo stesso fornitore. Per questo motivo, il metodo qui descritto utilizza costantemente l’acetilazione e la succinylazione come esempio, entrambi utilizzano perline coniugate anticorpi (Cell Signaling Technology, Inc). Anche se questo metodo può teoricamente essere applicato a un numero qualsiasi di PTM, sarebbero necessari ulteriori studi per valutare l’esatta limitazione del protocollo a questo proposito. Inoltre, poiché si tratta di un metodo di arricchimento basato su anticorpi, il metodo può fornire solo una quantificazione relativa dei siti PTM.
Rispetto ai metodi di arricchimento multi-PTM esistenti, questo flusso di lavoro è un’alternativa più fattibile ed economica. Da questo esperimento, è stato osservato che l’efficacia di questo metodo si confronta molto bene con metodi alternativi, come gli arricchimenti individuali o seriali. La figura 2B mostra che il CV mediano per le aree di picco peptidiche modificate è stato effettivamente diminuito nel metodo one-pot rispetto agli arricchimenti a PTM singolo e agli arricchimenti seriali-PTM13. Abbiamo analizzato ulteriormente i risultati sperimentali valutando le quantificazioni a livello di sito per l’acetilazione o la succinylazione. Inoltre, l’analisi di correlazione di Spearman (Figura 2C,D) ha dimostrato che l’arricchimento PTM con un solo vaso ha eseguito in modo simile ai flussi di lavoro di arricchimento a PTM singolo. Ciò valeva anche per le correlazioni a livello di peptide e di frammento. La stessa osservazione ha tenuto per tutte e tre le correlazioni quando si confronta un vaso con l’arricchimento seriale-PTM.
Questo protocollo consente ai ricercatori di fare affascinanti intuizioni biologiche sul crosstalk PTM in modo rapido ed economico. La componente DIA del flusso di lavoro consente ai ricercatori di comprendere meglio i PTM, in quanto fornisce informazioni sulla localizzazione del sito e supera sfide come la bassa occupazione del sito di PTM. Gli ioni precursori tendono ad essere esclusi con La DDA, che è particolarmente importante quando studiano i PTM, poiché l’occupazione del sito è spesso bassa al punto che questi peptidi non vengono selezionati per MS/MS ma contengono ancora informazioni cruciali. È possibile eseguire esperimenti di follow-up per valutare il limite superiore di quanti PTM possono essere arricchiti contemporaneamente utilizzando questo metodo. Un miglioramento futuro di questo flusso di lavoro può includere lo sviluppo di piattaforme software più avanzate per automatizzare ulteriormente l’analisi della localizzazione del sito e l’occupazione del sito PTM.
The authors have nothing to disclose.
Riconosciamo il sostegno della sovvenzione di strumentazione condivisa NIH per il sistema TripleTOF presso il Buck Institute (1S10 OD016281). Questo lavoro è stato sostenuto anche dall’Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive (da R01 AI108255 a B.S.) e dall’Istituto Nazionale di Diabete e Malattie Digestive e Renali (da R24 DK085610 a Eric Verdin; R01 DK090242 a Eric Goetzman). X.X. è stato sostenuto da una sovvenzione del National Institutes of Health (NIH grant T32GM8806, a Judith Campisi e Lisa Ellerby), N.B. è stata sostenuta da una borsa di studio post-dottorato della Glenn Foundation for Medical Research.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |