Здесь мы описываем простую и доступную стратегию визуализации, количественной оценки и картирования иммунных клеток в формалина-фиксированных парафин-встроенных секций опухолевых тканей. Эта методология сочетает в себе существующие методы визуализации и цифрового анализа с целью расширения возможностей мультиплексирования и многопарамесного анализа анализов изображений.
Иммунный ландшафт микроокружения опухоли (TME) является определяющим фактором в прогрессии рака и ответ на терапию. В частности, плотность и расположение иммунных клеток в TME имеют важные диагностические и прогноститические значения. Мультитомическое профилирование TME экспоненциально увеличило наше понимание многочисленных клеточных и молекулярных сетей, регулирующих инициацию и прогрессирование опухоли. Однако эти методы не дают информации о пространственной организации взаимодействий клеток или клеток. Доступные, доступные и простые в исполнении методы мультиплексирования, позволяющие пространственное разрешение иммунных клеток в сечениях тканей, необходимы для дополнения технологий высокой пропускной связи на основе одной клетки. Здесь мы описываем стратегию, которая интегрирует серийную визуализацию, последовательное обозначение и выравнивание изображения для создания виртуальных многопаративных слайдов целых секций ткани. Виртуальные слайды впоследствии анализируются автоматически с помощью пользовательских протоколов, которые позволяют идентифицировать, количественно и картографировать группы клеток, представляющие интерес. Анализ изображений выполняется, в данном случае с помощью аналитических модулей Tissuealign, Author и HISTOmap. Мы представляем пример, когда мы успешно применили эту стратегию к одному клиническому образцу, максимизируя информацию, которую можно получить из ограниченных образцов тканей, и обеспечивая объективное представление о TME во всей секции тканей.
Развитие рака является результатом многоступенчатого процесса, включающегося в взаимные взаимодействия между злокачественными клетками и ТМЭ. Помимо опухолевых клеток, TME состоит из незлокачественных клеток, стромальных клеток, популяций иммунных клеток и внеклеточной матрицы (ECM)1. Пространственная организация различных клеточных и структурных компонентов опухолевой ткани и динамический обмен между раком и соседними нераковыми клетками в конечном счете модулируют прогрессирование опухоли и ответ на терапию2,3,4. Было показано, что иммунный ответ при раке пространственно регулируется5,,6. Различные популяции иммунных клеток, проникающие в неопластическое повреждение и прилегающие ткани, обладают отличительными пространственными структурами распределения и разнообразными состояниями активации и дифференциации, связанными с различными функциями (например, про-против противоопухолевых). Эти различные иммунные популяции и их параметры coevolve сверхурочно с опухолью и стромальных отсеков.
Появление технологий, позволяющих профилировать одноклеточную мультиомику, экспоненциально повысило наше понимание многочисленных клеточных и молекулярных сетей, регулирующих канцерогенез и прогрессирование опухоли. Тем не менее, большинство одноклеточных высокопроизводительных аналитических инструментов требуют нарушения тканей и изоляции одноклеточных клеток, что приводит к потере информации о пространственной организации клеток и взаимодействий клеток7. Поскольку расположение и расположение конкретных иммунных клеток в TME имеют диагностическое и прогностическое значение, технологии, позволяющие пространственное разрешение являются важным дополнением методов иммунного профилирования на основе одной клетки.
Традиционно методы визуализации, такие как иммуногистохимия (IHC) и мультиплекс иммунофлуоресценция (mIF) были ограничены небольшим количеством биомаркеров, которые могут быть визуализированы одновременно. Это ограничение препятствует изучению пространственно-временной динамики инфильтрационных иммунных клеток, которые обычно определяются несколькими фенотипическими маркерами. Последние достижения в области визуализации и аналитических инструментов расширили возможности мультиплексирования. Новые антитела на основе технологий маркировки, как гисто-цитометрия и визуализации массы цитометрии были использованы для пространственно отделить до 12 и 32 биомаркеров, соответственно8,9. Масс-спектрометрия изображения, техника, не требующая маркировки, имеет потенциал для изображения тысячи биомаркеров одновременно в одной ткани раздел10,11. Хотя эти методы уже показали большой потенциал для вскрытия иммунного ландшафта тканей при раке, они используют очень сложное и дорогостоящее оборудование и программное обеспечение и не легко доступны для большинства исследователей.
Кроме того, мультиплексирование возможности традиционных IHC и mIF была расширена за счет использования серийных изображений, последовательных раундов маркировки, и спектральной визуализации7,12,13,14,15,16. Эти методы генерируют несколько изображений из одних и тех же или из последовательных секций тканей, которые могут быть объединены в виртуальные многопаративные слайды с помощью программного обеспечения для анализа изображений. В результате одновременно увеличивается количество маркеров, которые можно визуализировать и анализировать.
Здесь мы предлагаем стратегию рационального проектирования анализов мультиплексов тканей с использованием коммерчески доступных реагентов, доступного оборудования для микроскопии и удобного программного обеспечения(рисунок 1). Эта методология интегрирует серийную визуализацию, последовательное мультиплексное обозначение, визуализацию целых тканей и выравнивание тканей для создания виртуальных многопаративных слайдов, которые могут быть использованы для автоматической количественной оценки и картирования иммунных клеток в сечениях тканей. Используя эту стратегию, мы создали один виртуальный слайд, состоящий из 11 биомаркеров плюс два часто используемых гистологических пятен: гематоксилин и эосин (H и E) и picrosirius красный (PSR). Несколько популяций иммунных клеток были определены, расположены и количественно в различных отсеках ткани и их пространственное распределение решена с помощью тканях тепловых карт. Эта стратегия максимизирует информацию, которая может быть получена из ограниченных клинических образцов и применима к формалин-фиксированной парафина встроенных (FFPE) архивные образцы тканей, в том числе целые ткани, биопсии основных игл, и ткани microarrays. Мы предлагаем эту методологию в качестве полезного руководства для разработки пользовательских анализов для идентификации, количественной оценки и картирования популяций иммунных клеток в TME.
Простые, доступные и простые в исполнении методы мультиплексирования, которые позволяют пространственное разрешение иммунных клеток в секциях тканей, необходимы для картирования иммунного ландшафта при раке и других иммунологических расстройствах. Здесь мы описываем стратегию, которая интегрирует широко доступные методы маркировки и цифрового анализа для расширения возможностей мультиплексирования и многомерной оценки анализов изображений12,13,17,19. Окрашивание трех серийных секций для различных маркеров, а также повторное использование секций с помощью зачистки и reprobing методы, позволило нам визуализировать 11 параметров в дополнение к Н И Е и PSR пятна. Шесть изображений из этих разделов были выровнены в автоматическом режиме с помощью модуля выравнивания тканей. Выравнивание было точным на уровне отдельных клеток для изображений, происходящих из того же раздела и очень согласующимся для изображений, происходящих из соседних разделов. Виртуальный мультиплексирование позволило нам определить, как маркеры, визуализированные в одном разделе, пространственно соотносятся с маркерами, визуализированными в другом смежном разделе. В то время как некоторые из окрастей помечены COIs, другие помечены ТС, что позволяет нам количественно COIs в различных ТС. Использование программных средств для автоматизированной количественной оценки CoIs значительно упростило и ускорило обработку изображений. Кроме того, цифровой анализ применялся к целым участкам тканей вместо отдельных полей зрения, что привело к объективному представлению ТМЕ. Кроме того, поскольку были зарегистрированы координаты тканей COIs, удалось создать тепловые карты тканей.
В этом протоколе есть несколько областей, где может потребоваться устранение неполадок. Во-первых, плохое извлечение антигена может повлиять на качество mIF, поэтому тип буфера поиска антигена и продолжительность должны быть оптимизированы для конкретных условий проверки/биомаркера. Во-вторых, используемый тип блокирующего раствора должен быть адаптирован к тканям/антигену/видам первичных и вторичных антител. В наших руках, добавление 10% общей сыворотки от видов, где ткань поступает из заблокированных рецепторов Fc, и, таким образом, снижение неспецифических связывания антител. Добавление 10% сыворотки от вида вторичных антител были подняты в бы свести к минимуму прямое неспецифическое вложение вторичных антител к ткани разделе. В-третьих, важное значение имеет проверка специфичности первичных и вторичных антител с использованием надлежащего положительного и отрицательного контроля. В-четвертых, увеличение автофлюоресценции в некоторых каналах и диффузии DAPI на первичных зачистки антител также распространены. Для решения расширенной автофлюоресценции, мы использовали первичные / вторичные пары антител, где конкретный сигнал имел значения интенсивности по крайней мере 5x, что из фона. Наконец, некоторые антитела высокого сродства не могут быть eluted с регулярными процедурами зачистки. В этом случае мы рекомендуем использовать такие антитела в последнем раунде маркировки. Пользователю, возможно, придется попробовать различные последовательности окрашивания, чтобы найти оптимальную конфигурацию для антител, представляющих интерес. Эффективность зачистки должна быть подтверждена до начала второго или третьего раунда маркировки.
Основным ограничением и вызовом этой стратегии является поиск правильных комбинаций первичных и вторичных флуоресцентных антител для маркеров интереса. Поиск первичных антител, выращенных у различных видов или с различными изотипами, которые могут быть использованы одновременно, ограничен тем, что доступно на коммерческой уровне. Большинство целых слайд-сканеров оснащены лампами и фильтрами, которые позволяют изображения максимум пять каналов, и вторичные антитела в нужных видов и право фторфора не всегда доступны. Мы частично преодолели эти ограничения, используя серийные окрашивания и последовательную маркировку. Несколько комбинаций антител, возможно, потребуется проверить, чтобы прийти в наилучшей комбинации для маркеров интереса. Другим ограничением является качество окрашивания DAPI, потому что зачистка и reprobing не всегда может позволить выполнять сегментации ядер.
Модуль выравнивания тканей требует минимальной подготовки и никаких навыков программирования от пользователей. Программное обеспечение теоретически позволяет выравнивание неограниченное количество изображений. Однако точное выравнивание зависит от родственности секций, где более точно выровнены более близкие участки, которые более гистологически согласованы. Мы использовали авторский модуль VIS для генерации АПП. Базовые знания анализа изображений необходимы для создания АПП, но это в равной степени относится и к использованию любого другого программного обеспечения для анализа изображений. Уникальные преимущества VIS по сравнению с другим программным обеспечением анализа изображений включают автоматическое выравнивание изображений из разделов, подготовленных с использованием различных методов (например, IF, гистохимия, IHC). Это позволяет проводить исследования по локализации нескольких маркеров, представляющих интерес с помощью виртуального мультиплексирования. Кроме того, гибкий и удобный дизайн AP позволяет настраивать пользователей. Автоматизированная количественная оценка и картирование, а также возможность обработки целых секций тканей, экономит время и уменьшает предвзятость по сравнению с ручным подсчетом путем визуального осмотра.
Эта стратегия является очень полезным инструментом исследования для иммунологии тканей в контексте рака и аутоиммунных заболеваний, но остается недействительной для клинического использования. С дополнительной стандартизации и проверки, он может быть использован в будущем для нескольких приложений (например, для картирования иммунного ландшафта в раке, чтобы предсказать и контролировать ответ на иммунотерапевтических агентов). Он также может быть адаптирован к различным воспалительным условиям (например, воспалительные заболевания кишечника), чтобы объединить патологические оценки с прогностическими биомаркерами.
Основными важными шагами в этом протоколе являются эффективность/специфичность маркировки и надежность разработанных АПП для предполагаемого использования или биомаркера. Таким образом, регулярная проверка путем визуального осмотра, особенно при проектировании нового APP, имеет важное значение. Эффективное использование нескольких раундов зачистки и reprobing или различных типов пятен на одном и том же разделе являются важнейшими компонентами и могут быть ткани или раздел конкретных. Проверка эффективности таких процессов перед большим пакетным анализом имеет решающее значение.
Таким образом, мы предоставляем стратегию, которая максимизирует количественную и пространственную информацию, которая может быть получена из ценных образцов клинических тканей. Ресурсы, оборудование и знания, необходимые для внедрения этой методологии, широко доступны. Мы предлагаем эту методологию в качестве полезного руководства для планирования анализов, направленных на выявление, количественное определение и отображение популяций иммунных клеток в TME.
The authors have nothing to disclose.
Благодарим участника исследования. Мы благодарим Луизу Руссо, координатора биобанка HBP за восстановление образцов тканей и всей связанной с ними клинической информации. Мы признаем молекулярную патологию и клеточную визуализацию основных средств в CRCHUM и Майкл Перш из Visiopharm за отличную техническую помощь. Финансирование: Это исследование было поддержано грантами Канадского фонда печени, Fonds de recherche du Квебек-Санте (ФРЗС) по СПИДу и Сети инфекционных заболеваний (Reseau SIDA-MI) и Канадской сети по борьбе с гепатитом С (CanHepC). CanHepC финансируется за счет совместной инициативы Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR) (NHC-142832) и Агентства общественного здравоохранения Канады. М.Ф.М. получил стипендии от Монреальского университета, Бурса Гавриил маркизия и ФРЗС. Т.Ф. получил докторскую стипендию от CIHR и CanHepC. S.T. имеет кафедру Роджера-Де-Гроузеллерса в гепатобилиарной и онкологической хирургии поджелудочной железы, Монреальский университет.
Автор вкладов: M.F.M. разработан, выполнены эксперименты, и проанализировали данные. Т.Ф. разработал эксперименты. A.C-B. техническое руководство. Г.С. провел всю патологическую оценку испытое и внедвал в исследование всех патологических аспектов. Компания L.M. выполнила окрашивание, оптимизированное и выполненное приобретение изображений. M.N.A. выполнила пятно PSR и предоставила ценный технический вклад. Н.Б. внес свой вклад в анализ изображений. S.T. является главным исследователем биобанка HBP и отвечает за надзор за общей работой биобанка. Он также внедрит неоценимый вклад во все аспекты проекта и его клинические последствия. M.F.M., T.F. и N.H.S. концептуализировали и спроектировали исследование. N.H.S. контролировал работу и получал финансирование. М.Ф.М., Т.Ф., А.К.Б. и Н.Х.С. написали рукопись. Все авторы рассмотрели и утвердили рукопись.
Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0) | |||
Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS | |||
Bovine serum albumin (BSA) | Multicell | 800-095-EG | |
Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM) | Newcomersupply | 5300KIT | |
Cover slides | Fisherbrand | 12-545E 22*50 | |
Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 | |
Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
Ethanol 100% | |||
Electric pressure cooker | Salton | ||
Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | CAUTION, eye irritation |
Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion |
FFPE section (4μm) slides | |||
Glycine 0,1 M in PBS | |||
Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength | Ricca Chemical Company | 3535-32 | |
Holder (EasyDip Staining Jar Holder) | Newcomersupply | 5300RK | |
Human Serum | Gemini | 22210 | |
Humidity chamber | Millipore Sigma | Z670138-1EA | |
Pap pen | abcam | ab2601 | |
PBS | |||
PBS-Tween 20 (0.1% v/v) | |||
Permount Mounting Media | Fisher Chemical | SP15-500 | |
Picric Acid 1.3 % | Sigma Aldrich | P6744 | CAUTION, skin and eye irritation |
Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution | |||
Primary Antibody Anti-αSMA | Mouse IgG2a 1A4 | Sigma A2547 | Dilution 1/100 |
Primary Antibody Anti-CD34 | Mouse IgG1 HPCA1/763 | Novus Biologicals NBP2-44568 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18 | Rabbit EP17/EP30 | Agilent IR09461-2 | Ready to use |
Primary Antibody Anti-CD68 | Mouse KP1 | Abcam ab955 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-Desmin | Rabbit Polyclonal | Invitrogen PA5-16705 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-CD4 | Mouse N1UG0 | Affymetrix 14-2444 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-FoxP3 | Rabbit 1054C | R & D MAB8214 | Dilution 1/100 |
Primary Antibody Anti-MPO | Goat Polyclonal | R & D Systems AF3667 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-CD3 | Rabbit SP7 | Abcam ab16669 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-CD8 | Mouse C8/144B | Invitrogen 14-0085-80 | Dilution 1/200 |
Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21202 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21206 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-goat A568 | Polyclonal | Invitrogen A-11057 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647 | Polyclonal | Invitrogen A-31573 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647 | RMG1-1 | Biolegend 406618 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568 | Polyclonal | Sigma Aldrich SAB4600315 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10171 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10043 | Dilution 1/500 |
SDS | BioShop | SDS001,500 | CAUTION, oral skin and eye toxicity |
Shandon multi-program robotic slide stainer | LabX | 11384903 | |
Shandon Xylene Substitute, | Thermo Fisher Scientific | CA89413-336 | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
Shaking water bath | |||
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
Sodium Citrate Dihydrate | Millipore Sigma | 1545801 | CAUTION, eye irritation |
Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration) | |||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
VIS Software | Visiopharm | ||
Whole slide scanner Olympus BX61VS | Olympus | Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine® Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock) | |
Xylene | Sigma Aldrich | 214736-4L | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v) | |||
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood |