Anreicherung von Säugetiergeweben und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin

Cholesterin, ein wichtiges zelluläres Lipid, spielt zahlreiche kritische funktionelle und strukturelle Rollen^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}. Von der Regulierung der physikalischen Eigenschaften der Plasmamembran bis hin zur Sicherstellung der Zelllebensfähigkeit, des Wachstums, der Proliferation und der Funktion als Signal- und Vorläufermolekül in einer Vielzahl biochemischer Bahnen ist Cholesterin ein zwingender Bestandteil, der für die normale Zell- und Organfunktion notwendig ist. Als Ergebnis, Cholesterinmangel führt zu schweren körperlichen Fehlbildungen und eine Vielzahl von Störungen. Auf der anderen Seite, auch eine kleine Erhöhung des Cholesterins über physiologischen Niveaus (2-3x) ist zytotoxisch^1,2,10 und wurde mit der Entwicklung von Erkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf^11,12,13 und neurodegenerative Erkrankungen^14,15,16,17verbunden. Um die kritischen Funktionen des Cholesterins zu hinterfragen und die Wirkung von Veränderungen des Cholesterinspiegels zu bestimmen, wurden verschiedene Ansätze entwickelt, die den Cholesteringehalt in Geweben, Zellen und Xenopus-Oozyten verändern.

Veränderung des Cholesterinspiegels in Säugetiergeweben und -zellen
Mehrere Ansätze können genutzt werden, um den Cholesterinspiegel in Geweben und Zellen¹⁸zu senken. Ein Ansatz beinhaltet ihre Exposition gegenüber Statinen, die in Lipoprotein-defizigem Serum gelöst werden, um HMG-CoA-Reduktase zu hemmen, die die Rate der Cholesterinsynthese^{steuert 19,20}. Jedoch, Diese Cholesterin senkenden Medikamente hemmen auch die Bildung von Nicht-Sterol-Produkte entlang der Mevalonat-Weg. Daher wird eine kleine Menge Mevalonat hinzugefügt, um die Bildung dieser Produkte zu ermöglichen²¹ und die Spezifität dieses Ansatzes zu verbessern. Ein weiterer Ansatz zur Senkung des Cholesterinspiegels beinhaltet die Verwendung von Cyclodextrinen. Diese Glucopyranose-Monomere besitzen eine interne hydrophobe Höhle mit einem Durchmesser, der der Größe der Sterole²²entspricht, was die Extraktion von Cholesterin aus Zellen erleichtert und sie dadurch von ihrem nativen Cholesteringehalt²³erschöpft. Ein Beispiel ist 2-Hydroxypropyl-Cyclodextrin (HP-CD), ein präklinisches Medikament, das derzeit zur Behandlung der Niemann-Pick-Typ-C-Krankheit getestet wird, einer genetisch vererbten tödlichen Stoffwechselstörung, die durch lysosomale Cholesterinspeicherung gekennzeichnet ist²⁴. Der Grad des Cholesterinmangels hängt von dem verwendeten spezifischen Derivat ab. Zum Beispiel extrahiert HP-CD Cholesterin mit einer geringeren Kapazität als das methylierte Derivat, Methyl-A-Cyclodextrin (M-CD)^{24,25,26,27,28,29,30}. Vor allem aber können neben Cholesterin auch andere hydrophobe Moleküle extrahiert werden, die dann zu unspezifischen Wirkungen führen können³¹. Im Gegensatz zur Erschöpfung können Zellen und Gewebe durch die Behandlung mit dem mit Cholesterin²³vorgesättigten A-Cyclodextrin gezielt mit Cholesterin angereichert werden. Dieser Ansatz kann auch als Kontrolle für die Spezifität von ,,Cyclodextrinen” verwendet werden, die für den Cholesterinmangel verwendet werden³¹. Der Abbau von Cholesterin aus Geweben und Zellen ist einfach und kann erreicht werden, indem die Zellen für 30-60 min bis 5 mM M’CD in dem Medium, das für die Lagerung der Zellen verwendet wird, gelöst werden. Dieser Ansatz kann zu einer 50%igen Abnahme des Cholesteringehalts führen (z.B. in Hippocampus-Neuronen³², Rattenhirnarterien³³). Auf der anderen Seite ist die Vorbereitung des “Cyclodextrin-Cholesterin-Komplexes” für die Cholesterinanreicherung von Gewebe und Zellen komplexer und wird im Protokollabschnitt beschrieben.

Ein alternativer Ansatz zur Anreicherung von Geweben und Zellen mit mit Cholesterin gesättigtem X-Cyclodextrin beinhaltet die Verwendung von LDL, das auf LDL-Rezeptoren beruht, die in den Geweben/Zellen¹⁸exprimiert werden. Während dieser Ansatz bietet den Vorteil der Verwendung der natürlichen Cholesterin Homöostase Maschinerie der Zelle, Es hat mehrere Einschränkungen. Erstens können Gewebe und Zellen, die den LDL-Rezeptor nicht ausdrücken, mit diesem Ansatz nicht angereichert werden. Zweitens enthalten LDL-Partikel neben Cholesterin auch andere Lipide. Insbesondere besteht LDL aus dem Protein ApoB₁₀₀ (25%) und die folgenden Lipide (75%): 6-8% Cholesterin, 45-50% Cholesterylester, 18-24% Phospholipide und 4-8% Triacylglycerole³⁴. Daher ist die Abgabe von Cholesterin über LDL-Partikel unspezifisch. Drittens kann der prozentuale Anstieg des Cholesteringehalts durch LDL in Geweben und Zellen, die den LDL-Rezeptor ausdrücken, signifikant niedriger sein als der Mit dem Cholesteringehalt beobachtete Anstieg. Zum Beispiel, in einer früheren Studie, Anreicherung von Nagetier Hirnarterien mit Cholesterin über LDL führte nur zu einem 10-15% Anstieg des Cholesterinspiegels³⁵. Im Gegensatz dazu führte die Anreicherung dieser Arterien mit Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, wie im Protokollabschnitt beschrieben, zu einer >50%igen Erhöhung des Cholesteringehalts (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 1).

Veränderung des Cholesterinspiegels in Xenopus Oozyten
Xenopus Oozyten bilden ein heterologes Expressionssystem, das häufig zur Untersuchung der Zell- und Proteinfunktion verwendet wird. Frühere Studien haben gezeigt, dass das Cholesterin-Zu-Phospholipid-Molaren-Verhältnis in Xenopus-Oozyten 0,5 x 0,1³⁶beträgt. Aufgrund dieses intrinsischen hohen Cholesterinspiegels ist die Erhöhung des Cholesterinspiegels in diesem System eine Herausforderung, kann aber mit Dispersionen aus Membranphospholipiden und Cholesterin erreicht werden. Die Phospholipide, die wir für diesen Zweck gewählt haben, ähneln denen, die zur Bildung künstlicher planarer Lipid-Doppelschichten verwendet werden, und umfassen L-A-Phosphatidylethanolamin (POPE) und 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serin (POPS), wie im Protokollabschnitt beschrieben. Dieser Ansatz kann zu >50% Anstieg des Cholesteringehalts führen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 2).

Ein alternativer Ansatz zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit phospholipidbasierten Dispersionen beinhaltet die Verwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, was der Art und Weise ähnelt, wie Gewebe und Zellen angereichert werden. Wir haben jedoch festgestellt, dass dieser Ansatz von geringer Reproduzierbarkeit und Effizienz ist, mit einem durchschnittlichen Anstieg des Cholesteringehalts um 25 %. Dies ist möglicherweise auf die unterschiedliche Belastbarkeit dieser beiden Ansätze zurückzuführen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 3). Im Gegensatz dazu hat sich gezeigt, dass die Verwendung von Cyclodextrin, um Cholesterin aus Xenopus Oozyten zu erschöpfen, zu einer Abnahme des Cholesteringehalts um 40 % führen kann³⁶.

Hier konzentrieren wir uns auf die Cholesterinanreicherung von Säugetiergeweben und -zellen durch die Anwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, und von Xenopus Oozyten mit Liposomen. Beide Ansätze können genutzt werden, um die Wirkung eines erhöhten Cholesterinspiegels auf die Proteinfunktion abzuleiten. Die Mechanismen der Cholesterinmodulation der Proteinfunktion können direkte Wechselwirkungen⁸ und/oder indirekte Effekte^{beinhalten 9}. Wenn Cholesterin die Proteinfunktion über direkte Wechselwirkungen beeinflusst, ist die Wirkung eines Anstiegs des Cholesterinspiegels auf die Proteinaktivität wahrscheinlich unabhängig vom Zelltyp, Expressionssystem oder Anreicherungsansatz. Zum Beispiel nutzten wir diese beiden Ansätze, um die Wirkung von Cholesterin auf G-Protein-Gated-Innen-Rektifizierenden Kaliumkanälen (GIRK) zu bestimmen, ausgedrückt in Vorhoffnden Myozyten³⁷, Hippocampus-Neuronen^32,38, HEK293³⁹ Zellen und Xenopus-Oozyten ^32,37. Die in diesen Studien erzielten Ergebnisse waren konsistent: in allen drei Arten von Säugetierzellen und in Amphibien-Oozyten wurde die GIRK-Kanalfunktion von Cholesterin hochreguliert (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 4, für Hippocampus-Neuronen und die entsprechenden Experimente in Xenopus-Oozyten). Darüber hinaus stimmten die in diesen Studien gemachten Beobachtungen auch mit den Ergebnissen von Studien überein, die an den Vorhofmyozyten^37,40 und hippocampalneuronen^32,38 frisch isoliert von Tieren, die einer hohen Cholesterindiät ausgesetzt^{waren, 40}durchgeführt wurden. Bemerkenswert ist, dass die Cholesterinanreicherung von Hippocampus-Neuronen mit M-CD die Wirkung der Atorvastatin-Therapie, die zur Bekämpfung der Auswirkungen der hohen Cholesterin-Diät sowohl auf den Cholesterinspiegel als auch auf die GIRK-Funktion^verwendetwird, umkehrte. In anderen Studien untersuchten wir die Wirkung von Mutationen auf die Cholesterinempfindlichkeit des nach innen korrigierenden Kaliumkanals Kir2.1 mit Xenopus-Oozyten und HEK293-Zellen⁴¹. Auch hier war die Wirkung der Mutationen auf die Empfindlichkeit des Kanals in den beiden Systemen ähnlich.

Die Anwendungen beider Anreicherungsmethoden zur Bestimmung der Auswirkungen erhöhter Cholesterinspiegel auf die Molekular-, Zell- und Organfunktion sind zahlreich. Insbesondere die Verwendung von Cyclodextrin-Cholesterin-Komplexen zur Anreicherung von Zellen und Geweben ist aufgrund seiner Spezifität sehr häufig. Jüngste Beispiele für diesen Ansatz sind die Bestimmung der Auswirkungen von Cholesterin auf herG-Kanalaktivierung und zugrunde liegende Mechanismen⁴², die Entdeckung, dass Cholesterin aktiviert die G-Protein gekoppelt Rezeptor Geglättet, um Hedgehog Signalisierung⁴³zu fördern , und die Identifizierung der Rolle von Cholesterin in Stammzell Biomechanik und Adipogenese durch Membran-assoziierte Linker Proteine⁴⁴. In unserer eigenen Arbeit nutzten wir die Anreicherung von Säugetiergewebe mit dem M-CD:Cholesterin-Komplex, um die Wirkung der Cholesterinanreicherung auf die Grundfunktion und das pharmakologische Profil von Kalzium- und Spannungskanälen großer Leitfähigkeit (BK, MaxiK) im vaskulären Glattmuskel^35,45,^46zuuntersuchen. In anderen Studien verwendeten wir den Phospholipid-basierten Dispersionsansatz zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit Cholesterin, um die Rollen verschiedener Regionen in Kir2.1- und GIRK-Kanälen in der Cholesterinempfindlichkeit^41,47,48,49, sowie zur Bestimmung vermeintlicher Cholesterinbindungsstellen in diesen Kanälen^32,50,^51zubestimmen.